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　　细胞克隆形成实验，作为细胞生物学中的关键技术之一，不仅在学术研究中有着广泛应用，更在药物筛选、癌症研究等领域发挥着重要作用。通过此实验，我们能够深入了解细胞的增殖能力、侵袭性，以及对不同治疗因素的敏感性，为生物医药领域的创新提供坚实的基础。

　　本期文章，我们将深度解析平板克隆和软琼脂克隆这两种常用实验方法，揭示它们的原理、实验步骤以及注意事项！

　　细胞克隆实验作为一项关键技术，被广泛应用于生物学领域，以评估细胞的增殖、侵袭性和对杀伤因素的敏感性等生物特性。在实验中，当单个细胞在离体条件下经过连续6代以上的增殖时，其后代将形成一个集体，通常被称为细胞集落或克隆。细胞克隆形成率是一个衡量指标，表示细胞在接种后能够存活并形成克隆的数量，即成功贴壁并展现增殖活力的细胞比例。

　　并非所有贴壁的细胞都能成功增殖和形成克隆，而只有那些成功贴壁并具备增殖活力的细胞才能成功形成克隆。因此，克隆形成率反映了细胞群体的依赖性和增殖能力这两个重要特性，为生物学研究提供了有价值的数据。

　　通过细胞克隆形成实验，我们能够评估细胞在处理后的增殖能力，具体表现为观察处理后的细胞在培养板上形成克隆的能力。这一实验不仅能够提供对细胞增殖能力的直观量化，还有助于评估不同杀伤因素（如药物或基因）对肿瘤细胞增殖能力和群体依赖性的敏感性。

　　该实验的另一个重要应用是评估细胞在体内形成肿瘤的潜力。并非所有癌细胞都具备在体内形成肿瘤的能力，但如果细胞在离体条件下表现出强大的克隆形成能力，这可能提示它们在体内形成肿瘤的潜力较大。因此，这种实验可以被视为一种模拟体内肿瘤形成的离体实验，为研究肿瘤生物学提供了有益的信息。

　　细胞克隆形成实验可根据所采用的培养介质的不同分为两种主要类型：平板克隆和软琼脂克隆。

　　这一方法涉及将细胞培养在固体培养基上，通常适用于那些具有贴壁生长特性的细胞，使得细胞能够附着在培养基表面。在平板克隆形成实验中，细胞形成的克隆被定量测定，从而评估细胞的增殖能力。

　　这一技术涉及将细胞混合到琼脂糖中，使得细胞在琼脂糖中悬浮，而不是附着在培养基表面。软琼脂克隆形成主要应用于研究悬浮生长的肿瘤细胞和转化细胞系。通过这种方法，我们能够评估细胞在三维环境中形成克隆的能力，从而更全面地了解其增殖和侵袭特性。

　　下文将详细探讨这两种实验技术的具体操作步骤，以便更深入地理解它们在生物学研究中的应用。

　　材料：基础培养基(根据细胞选择适用种类)、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青霉素-链霉素溶液(100X)、多聚甲醛固定、结晶紫染液、 Giemsa染液 。

　　1.将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)重悬成细胞悬液，并计数。

　　2.细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔)。

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　　3.继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态。

　　4.克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次。

　　6.PBS 洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照(分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照)。

　　1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)中备用。

　　2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组5个平行样。每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

　　4.当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

　　8.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

　　1.平板克隆形成实验是一种容易操作的方法，特别适用于那些贴壁生长的细胞。这种实验通常在玻璃底或塑料培养皿上进行。

　　2.实验的关键成功因素在于细胞悬液的制备和接种密度。细胞悬液必须确保细胞均匀分散，不能有细胞团，而且接种密度不应过高。

　　使用显微镜观察阳性克隆，即每个克隆包含超过50个细胞，然后使用相机拍照记录。随后，进行克隆数量的计算，这些克隆的大小通常在0.3到1.0毫米之间，并统计各个克隆的大小。

　　例如，在研究某个基因对细胞增殖的影响，如敲低前列腺癌细胞株PC3的TCTN1基因，可以使用显微镜拍摄图像（比例尺为250微米），然后使用相机拍摄照片。结果显示，TCTN1基因的敲低抑制了克隆的形成，减小了克隆的数量和大小。

　　软琼脂克隆形成实验，又被称为非锚定依赖性生长实验（Anchorage-independent assay），利用软琼脂作为培养介质，推动细胞在悬浮状态下进行生长。某些恶性肿瘤细胞不仅在贴壁状态下能够增殖，而且在悬浮状态下同样能够展现增殖能力。这种通过在软琼脂中形成克隆的能力能够有效反映细胞的恶性程度。

　　软琼脂克隆形成实验不仅可用于深入研究细胞分化的基本原理，同时也为评估临床肿瘤治疗的疗效提供了有力工具。在医学和生物学领域，该实验发挥着重要的作用，为我们更全面地理解细胞行为、肿瘤发展机制以及潜在治疗策略的效果提供了关键信息。

　　1.配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，维持在42℃中使其不会凝固。

　　2.将1.2% 琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固。

　　3.将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次。

　　4.根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色，37°C过夜，拍照。

　　例：通过软琼脂克隆形成实验检测ME2蛋白对神经胶质瘤细胞生长的影响。在神经胶质瘤细胞GBM8401中将ME2蛋白敲低，形成的克隆数减少。

　　1.在培养皿中涂覆上层的软琼脂，以确保细胞分散成单个状态；接下来，涂抹下层的软琼脂，起到支撑作用，以防止细胞附着并生长。最后，涂覆一层培养基，以防止琼脂干燥，并为细胞提供所需的养分。如果需要对细胞进行药物处理，药物可以添加到培养基中。

　　2.上层软琼脂中的细胞数量会根据不同的细胞类型而有所不同。通常，使用5000个细胞/孔作为起始浓度，但可以根据需要进行调整。

　　3.琼脂需要在水浴锅中维持在约42℃左右的温度。如果温度太低，琼脂会凝固，而如果在制备底层琼脂时凝固过快，可能导致不均匀。另一方面，温度过高可能会导致细胞受热而死亡。此外，在实验过程中需要操作迅速，以防止局部结块的发生。

　　在选择细胞克隆方法时，至关重要的是充分考虑实验对象和研究目的。平板克隆适用于评估贴壁肿瘤细胞的增殖能力和致瘤性，而软琼脂克隆形成实验不仅适用于贴壁细胞，还能有效检测悬浮肿瘤细胞和转化细胞系，因此在某些方面具有平板克隆无法替代的优势。

　　若只需简单评估贴壁细胞的增殖能力和群体依赖性，选择平板克隆方法已足够。然而，若研究需要更全面地涵盖悬浮细胞或转化细胞系的特性，那么软琼脂克隆形成实验可能更为适合。因此，在选择克隆方法时，需综合考虑研究深度和范围，以确保选用的方法与研究目标相契合。

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