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　　2、1K 67/027(2006.01) (54)发明名称 利用体细胞克隆制备克隆猫的方法 (57)摘要 本发明涉及体细胞克隆猫的方法， 其中利用 马绒毛膜促性腺激素(PMSG)联合人绒毛膜促性 腺激素(HCG)， 经物理刺激实现家猫的同期发情 并超数排卵， 通过冲卵(单侧输卵管冲卵或者双 侧输卵管冲卵)获得了体内成熟的家猫卵母细 胞。 权利要求书1页 说明书9页 CN 111718962 A 2020.09.29 CN 111718962 A 1.体细胞克隆猫的方法， 所述方法包括如下步骤： (1)体细胞的分离培养； (2)制备去核 卵母细胞； (3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中； (4)。

　　3、激活克隆胚胎； (5)将步骤(4)获 得的克隆胚胎移植到受体母猫； 其特征在于， 去核卵母细胞获自受体母猫异体或自体只单 侧冲卵的受体母猫冲卵那侧的输卵管； 以及在上述步骤(5)中， 将克隆胚胎移植到受体母猫 未冲卵那侧的输卵管中。 2.体细胞克隆猫的方法， 所述方法包括如下步骤： (1)体细胞的分离培养； (2)制备去核 卵母细胞； (3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中； (4)激活克隆胚胎； (5)将步骤(4)获 得的克隆胚胎移植到受体母猫； 其特征在于， 去核卵母细胞获自绝育猫的卵巢， 经体外成熟 获得成熟的卵母细胞， 然后进行去核处理； 以及在上述步骤(5)中， 将克隆胚胎移植到受。

　　4、体 母猫未冲卵那侧的输卵管中。 3.体细胞克隆猫的方法， 所述方法包括如下步骤： (1)体细胞的分离培养； (2)制备去核 卵母细胞； (3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中； (4)激活克隆胚胎； (5)将步骤(4)获 得的克隆胚胎移植到受体母猫； 其特征在于： 一部分去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体 母猫冲卵的输卵管， 另一部分去核卵母细胞获自进行了冲卵的供体母猫的输卵管； 以及在 上述步骤(5)中， 将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。 4.根据权利要求1-3任一项的方法， 其中， 在所述步骤(1)中体细胞来自皮肤、 肌肉、 耳、 乳腺、 输卵管或卵巢。 5.根据权利要求4的。

　　5、方法， 所述体细胞为皮肤细胞、 上皮细胞、 耳细胞、 成纤维细胞、 内 皮细胞、 肌肉细胞、 乳腺细胞、 输卵管细胞、 卵巢细胞、 卵丘细胞、 神经细胞或成骨细胞。 6.根据权利要求1或2的方法， 其中， 在步骤(2)中， 用PMSG和HCG处理受体母猫后确定受 体母猫的发情和排卵， 然后进行单侧或双侧冲卵获得成熟的卵母细胞， 再进行成熟卵母细 胞的去核处理， 优选地， 通过形态学观察， 确认所有进行注核的卵母细胞均已去核。 7.根据权利要求6的方法， 所述PMSG的用量为100-600单位(IU)， 所述HCG的用量为100- 300单位(IU)。 8.根据根据权利要求1-3任一项的方法， 。

　　6、其中， 在步骤(3)中， 所述融合方法是用仙台病 毒进行融合， 优选地， 在细胞中加入1的仙台病毒稀释液重悬细胞， 离心， 弃上清， 用3倍稀 释仙台病毒重悬细胞， 冰浴， 将细胞悬液放入操作液中， 挑选细胞进行注核。 9.根据根据权利要求1-3任一项的方法， 其中， 在步骤(3)中， 所述融合方法为电融合， 所述电融合的电压为1.0-3KV/cm， 优选地， 电压为1.0-1.6KV/cm。 10.根据根据权利要求1-3任一项的方法， 其中， 在步骤(3)中， 所述融合方法是仙台病 毒融合结合电融合， 所述电融合的电压为1.0-3KV/cm， 优选地， 电压为1.0-1.6KV/cm。 权利。

　　7、要求书 1/1 页 2 CN 111718962 A 2 利用体细胞克隆制备克隆猫的方法 技术领域 0001 本发明涉及利用体细胞克隆的方法。 尤其是， 本发明涉及体细胞克隆猫的方法。 背景技术 0002 动物克隆技术是将细胞通过核移植， 转移至受体卵母细胞内， 生产与供体细胞具 有相同DNA序列信息的动物个体。 该技术的最大特点是， 所出生的克隆动物具有与供体细胞 完全一致的遗传信息。 因此采用克隆技术可以复制动物， 并且体细胞克隆技术可应用于转 基因动物生产、 优良家畜扩繁、 濒危动物资源保存、 进行治疗性克隆等。 0003 首例体细胞克隆猫于2002年获得成功， 由美国科学家Taeyou。

　　8、ng Shin的科研团队 完成， Shin等首次以供体母猫的卵丘细胞为核供体， 成功获得存活后代。 随后Gmez等利用 非洲野猫作为供体细胞供体进行克隆， 成功获得2只存活克隆幼猫， 这是利用这一技术生产 的首批野生食肉动物。 2005年韩国科学家对比了猫胎儿成纤维细胞和成猫皮肤成纤维细胞 作为供体细胞进行核移植后的胚胎发育能力， 结果表明成体细胞可用于猫科动物的克隆。 随后在2008年， Yin等利用克隆猫的皮肤细胞用于SNCT产生了第二代克隆猫， 证实克隆猫可 以作为供体猫来产生第二代克隆猫。 Yin等还利用转导红色荧光蛋白(RFP)基因逆转录病毒 载体的体细胞作为供体细胞用于SNCT， 。

　　9、并成功获得表达RFP的克隆转基因猫， 证实了利用遗 传修饰的体细胞同样可以用于克隆猫。 这些研究均为濒危猫科动物的保护提供了技术支 持。 0004 然而， 上述的克隆技术均需要通过绝育手术或者诱导发情-摘除卵巢获得猫卵巢， 利用切割卵巢的方法获得卵母细胞-卵丘细胞复合体， 体外培养获得猫成熟的卵母细胞； 或 者体外培养从绝育的猫卵巢获得的卵母细胞； 经体细胞核移植技术制备克隆猫重构胚胎； 将胚胎移植到发情同期的代孕母猫输卵管内， 代孕母猫分娩获得克隆猫。 0005 因此， 为了获得猫成熟的卵母细胞， 均需要摘除猫的卵巢， 然后通过切割卵巢获得 卵母细胞-卵丘细胞复合体， 通过体外培养获得成熟的。

　　10、卵母细胞， 无法直接得到成熟的卵母 细胞； 而且现有体细胞克隆猫的方法需要的实验猫数量多， 成本高， 无法实现产业化的应 用。 0006 而且， 现有技术中卵母细胞的体外成熟率比较低， 体外成熟卵母细胞质量低于体 内成熟卵母细胞， 克隆效率低。 发明内容 0007 本发明对体外成熟系统进行了优化， 使成熟的卵母细胞质量更高， 成熟率更高。 具 体而言， 本发明利用马绒毛膜促性腺激素(PMSG)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)， 经物理刺 激实现家猫的同期发情并超数排卵， 通过冲卵(单侧输卵管冲卵或者双侧输卵管冲卵)获得 了体内成熟的家猫卵母细胞， 本发明的方法超排效果好， 得卵率(成熟卵母细胞。

　　11、)高， 卵质量 好， 克隆效率高。 0008 第一方面， 本发明提供了体细胞克隆猫的方法， 所述方法包括如下步骤： (1)体细 说明书 1/9 页 3 CN 111718962 A 3 胞的分离培养； (2)制备去核卵母细胞； (3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中； (4)激 活克隆胚胎； (5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母猫； 其特征在于， 去核卵母细胞获 自受体母猫异体或自体只单侧冲卵的受体母猫冲卵那侧的输卵管； 以及在上述步骤(5)中， 将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。 0009 优选地， 在所述步骤(1)中， 体细胞可以是来自各种组织和器官， 例如皮肤、 肌。

　　12、肉、 耳、 乳腺、 输卵管、 卵巢等的细胞。 可用于本发明方法的体细胞的例子包括但并不限于： 皮肤 细胞、 上皮细胞、 耳细胞、 成纤维细胞、 内皮细胞、 肌肉细胞、 乳腺细胞、 输卵管细胞、 卵巢细 胞、 卵丘细胞、 神经细胞、 成骨细胞等。 0010 优选地， 在步骤(2)中， 用PMSG和HCG处理受体母猫后确定受体母猫的发情和排卵， 然后进行单侧或双侧冲卵获得成熟的卵母细胞， 再进行成熟卵母细胞的去核处理。 0011 优选地， 所述PMSG的用量为100-600单位(IU)， 所述HCG的用量为100-300单位 (IU)。 0012 优选地， 在步骤(3)中， 所述融合方法可以是用仙。

　　13、台病毒进行融合。 0013 优选地， 在步骤(3)， 所述融合方法可以是电融合。 电融合的电压范围为1.0-3KV/ cm， 优选地， 电压为1.0-1.6KV/cm。 0014 优选地， 在步骤(3)中， 所述融合方法可以是仙台病毒融合结合电融合， 所述电融 合的电压范围为1.0-3KV/cm， 优选地， 电压为1.0-1.6KV/cm。 0015 第二方面， 本发明提供了体细胞克隆猫的方法， 所述方法包括如下步骤： (1)体细 胞的分离培养； (2)制备去核卵母细胞； (3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中； (4)激 活克隆胚胎； (5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母猫； 其特。

　　14、征在于， 去核卵母细胞获 自绝育猫的卵巢， 经体外成熟获得成熟的卵母细胞， 然后进行去核处理； 以及在上述步骤 (5)中， 将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。 0016 优选地， 在所述步骤(1)中， 体细胞可以是来自各种组织和器官， 例如皮肤、 肌肉、 耳、 乳腺、 输卵管、 卵巢等的细胞。 可用于本发明方法的体细胞的例子包括但并不限于： 皮肤 细胞、 上皮细胞、 耳细胞、 成纤维细胞、 内皮细胞、 肌肉细胞、 乳腺细胞、 输卵管细胞、 卵巢细 胞、 卵丘细胞、 神经细胞、 成骨细胞等。 0017 优选地， 在步骤(3)中， 融合方法可以是用仙台病毒进行融合。 0018 优选地，。

　　15、 在步骤(3)， 融合方法可以是电融合。 电融合的电压范围为1.0-3KV/cm， 优 选地， 电压为1.0-1.6KV/cm。 0019 优选地， 在步骤(3)中， 融合方法可以是仙台病毒融合结合电融合， 所述电融合的 电压范围为1.0-3KV/cm， 优选地， 电压为1.0-1.6KV/cm。 0020 具体而言， 从动物医院收集健康绝育母猫的卵巢， 置于含37添加青链霉素的生 理盐水的保温杯中， 在4h内尽快运回实验室。 用无菌生理盐水清洗3次， 然后用眼科剪和镊 子小心分离卵巢周围的脂肪组织， 剥离卵巢， 并对卵巢状态进行评价， 挑选肉眼可见明显卵 泡的卵巢纳入试验。 将卵巢放入含10。

　　16、FBS的M199中， 用无菌刀片进行切割， 尽量释放卵母 细胞。 在显微镜下收集包裹2层以上， 胞质均一的卵丘卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟 培养。 培养基为SOF+3mg/ml BSA+1-5IU/mlHCG+0.5-1IU/ml PMSG+20ng/mlEGF， 每次使用前 需在培养箱中预热2h。 培养采取微滴培养的方式， 每100 L做一个微滴， 每滴不超过20个 COCs。 培养24h后放入含有0.1透明质酸酶的DPBS溶液中， 在37热台上， 利用口径COCs相 说明书 2/9 页 4 CN 111718962 A 4 近的胚胎吸管移液枪反反复吸吐， 将卵丘细胞移除。 在显微。

　　17、镜下挑选排出极体的卵母细胞 用作体细胞核移植。 0021 第三方面， 本发明提供了体细胞克隆猫的方法， 所述方法包括如下步骤： (1)体细 胞的分离培养； (2)制备去核卵母细胞； (3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中； (4)激 活克隆胚胎； (5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母猫； 其特征在于： 一部分去核卵母 细胞获自只单侧冲卵的受体母猫冲卵的输卵管， 另一部分去核卵母细胞获自进行了冲卵的 供体母猫的输卵管； 以及在上述步骤(5)中， 将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵 管中。 0022 优选地， 在所述步骤(1)中， 体细胞可以是来自各种组织和器官， 例如皮肤、 肌肉。

　　18、、 耳、 乳腺、 输卵管、 卵巢等的细胞。 可用于本发明方法的体细胞的例子包括但并不限于： 皮肤 细胞、 上皮细胞、 耳细胞、 成纤维细胞、 内皮细胞、 肌肉细胞、 乳腺细胞、 输卵管细胞、 卵巢细 胞、 卵丘细胞、 神经细胞、 成骨细胞等。 0023 优选地， 在步骤(2)中， 用PMSG和HCG处理受体母猫后确定受体母猫的发情和排卵， 然后进行单侧或双侧冲卵获得成熟的卵母细胞， 再进行成熟卵母细胞的去核处理。 0024 优选地， 所述PMSG的用量为100-600单位(IU)， 所述HCG的用量为100-300单位 (IU)。 0025 优选地， 在步骤(3)中， 融合方法可以是用仙台病毒。

　　19、进行融合。 0026 优选地， 在步骤(3)， 融合方法可以是电融合。 电融合的电压范围为1.0-3KV/cm， 优 选地， 电压为1.0-1.6KV/cm。 0027 优选地， 在步骤(3)中， 融合方法可以是仙台病毒融合结合电融合， 所述电融合的 电压范围为1.0-3KV/cm， 优选地， 电压为1.0-1.6KV/cm。 0028 可以看出， 本发明的体细胞克隆猫的方法的步骤(2)卵母细胞的获取方式有两种， 形式更丰富， 更容易产业化。 其中用PMSG和HCG处理母猫/输卵管冲卵的方法获得成熟的卵 母细胞， 一方面卵母细胞的质量更高(体内成熟卵母细胞质量比体外成熟卵母质量高)； 另 一方。

　　20、面可以不用摘除家猫卵巢， 减少实验猫的数量。 0029 因此， 可以看出， 本发明的胚胎移植方案可以采用自体、 异体、 自体/异体相结合3 种方式， 实现手段更多， 减少了发情母猫的需求数量。 并且自体移植受体母猫怀孕率更高， 降低了生产成本。 0030 而且， 本发明的方法中的采卵过程无需摘除猫的卵巢， 实现了周期化采卵， 减少了 实验猫的数量， 实现按计划生产的目的。 0031 在猫去核卵母细胞和猫供体细胞融合过程中使用了仙台病毒， 提高了融合效率。 0032 缩略语和关键术语定义： 0033 克隆： 采用相应的技术手段， 生产与供核细胞具有相同DNA序列的动物个体。 0034 NT： 体。

　　21、细胞核移植， 将犬成体细胞移植入去核的犬卵母细胞中构建克隆胚胎的方 法。 0035 DC： 供核细胞， 包含有完整的遗传物质的细胞， 将其移植入受体卵母细胞内用于制 备体细胞克隆动物。 0036 AET： 自体胚胎移植， 发情母犬冲出M II卵母细胞进行体细胞核移植后， 再以冲卵 母犬作为克隆胚胎移植的受体， 制备体细胞克隆犬。 说明书 3/9 页 5 CN 111718962 A 5 具体实施方式 0037 下面结合实施例及说明书对本发明的技术方案做进一步描述。 这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。 0038 实施例1： 0039 1.体细胞的分离培养 0040 体细胞。

　　22、克隆所用体细胞的供体猫为英国短毛猫( “大蒜” )。 首先用刮毛刀刮掉要采 集皮肤部位周围的毛， 利用75酒精消毒， 用高温灭菌后的剪刀剪取猫的皮肤组织约5mm2， 然后置入含有100IU/ml的青霉素+100IU/ml链霉素的DMEM基础培养基中， 低温运输尽快带 回实验室。 0041 组织块首先利用75酒精消毒漂洗10秒； 再用DMEM清洗5次， 用眼科剪小心去除脂 肪， 露出真皮层。 将皮肤组织转到另一个无菌培养皿中， 利用眼科剪尽量剪碎组织块。 用移 液枪将组织块移至培养皿的皿底， 用枪头将其铺均匀， 然后将培养瓶翻转， 加入含有20 FBS及5倍青链霉素的DMEM培养液， 放入环境为。

　　23、38、 5CO2、 饱和湿度的培养箱中培养。 6小 时后翻瓶， 使培养基完全浸没组织块后继续培养， 每48小时更换培养液一次， 10-14天冻存 细胞。 0042 2.体内成熟获得成熟的卵母细胞 0043 经超数排卵的母猫， 每组实验选5只猫同步肌肉注射PMSG200-500单位， 96h后注射 100-300IU HCG后人工刺激排卵， 40-48h进行手术冲卵。 暴露卵巢及子宫的宫管结合部， 将 带有圆形前端的金属注射针从卵巢囊的裂口处插入输卵管伞部； 在宫管结合部输卵管处将 插入注射针， 用含有10的FBS的TCM199培养基冲洗输卵管， 将长度为3cm的塑料管穿刺入 子宫内部， 然后使。

　　24、用冲卵液从宫管结合部冲洗卵母细胞。 供体猫则进行双侧输卵管冲卵， 获 得的卵母细胞用于体细胞核移植， 受体猫不进行冲卵或单侧冲卵。 将冲卵液置于显微镜下， 捡出卵母细胞， 放入含有0.1透明质酸酶的DPBS溶液中， 操作在37热台上进行， 利用口 径COCs相近的胚胎吸管反复吸吐， 将卵丘细胞移除。 在显微镜下挑选排出极体的卵母细胞 用作体细胞核移植。 0044 3.卵母细胞去核 0045 挑选成熟的卵母细胞在HCR+CB(5 g/mL)中处理5min， HCR+CB+H33342中染色5min, HCR+CB中去核， 去核后将针中取得的物质在紫外灯下照射以确定去核率。 去核后的卵在SOF 中。

　　25、恢复半小时。 0046 4.供体细胞准备 0047 供体细胞的准备： 细胞在核移植前经过2天的接触抑制或者血清饥饿处理， 使用时 先把准备好的细胞在高倍显微镜下观察细胞的生长状态和密度， 选好要的一孔进行消化。 用1ml无钙镁的PBS把细胞洗一遍， 使孔内没有血清了， 减少对胰酶的中和， 然后加入新配的 0.25的胰酶200ul左右， 放入培养箱中定时2分钟， 然后马上用1ml含血清的DMEM终止消 化， 用枪头吹打细胞， 收集全部的细胞到15ml无菌的离心管中， 1200RPM 5分钟。 弃上清， 加 100-200ul的培养液(HCR)备用。 0048 5.注核、 融合及激活 0049 使。

　　26、用灭活仙台病毒进行融合， 将选取的供体细胞放入仙台病毒微滴中处理几秒 后， 立即注射到卵母细胞透明带和细胞质之间， 用注射针轻轻点压透明带， 使体细胞与卵母 说明书 4/9 页 6 CN 111718962 A 6 细胞膜紧密结合构建重构胚。 放入SOF微滴中培养30分钟以后， 在体式显微镜下观察卵母细 胞细胞质和供体细胞的融合。 为了提高融合效率， 接着采用0.5mm融合槽进行电融合： 将重 构胚用1根不沾油的捡卵针洗净油， 并在融合液中平衡若干时间使复合体沉底， 用枪头吸 100 l融合液， 放入电极槽并吹洗， 再把液吸干(用此方法洗3遍)， 然后放入逐个将复合体放 入融合槽的平行电极之间。

　　27、。 不同的卵用不同的电压， 融合的重构胚采用的电压为约1.0KV/ CM， 2个脉冲， 间隔60 s， 进行电刺激。 未融合的胚使每一个体细胞处在12点或6点的位置用 电融合设备(BTX)进行电刺激， 电压为1.6KV/CM， 2个脉冲， 间隔60 s把卵从融合槽中用捡卵 针放入HCR液中， 待所有卵电击完后， 从HCR液中转移到SOF溶液中清洗至少三遍后， 放入SOF 微滴中培养30分钟以后， 再在体式显微镜下将能观察卵母细胞细胞质和供核细胞的融合， 统计融合效率。 判定为融合的重构胚用含10 g/ml CHX和5 g/ml CB的胚培养液激活4h， 完 成激活后进行胚胎移植。 0050 6。

　　29、9 表4克隆胚胎移植结果 0060 0061 0062 7.克隆猫鉴定结果 0063 为确定出生的克隆幼猫与体细胞供体猫(被克隆猫)是否具有相同的遗传信息， 以 及确定其与胚胎移植受体母猫的亲缘关系， 采集克隆幼猫的血液、 代孕母猫的血液及被克 隆猫的体细胞， 采用STR鉴定的方法， 确定克隆幼猫与被克隆猫的同一性关系、 克隆幼猫与 代孕母猫之间的亲子关系。 选择19个STR分别为Fe9、 Fe17、 Fe6、 Fe5、 Fe19、 Fe4、 Fe2、 Fe13、 Fe14、 Fe16、 Fe1、 Fe12、 Fe3、 Fe11、 Fe18、 Fe8、 Fe7、 Fe10、 AMEL。 本次鉴。

　　30、定由北京中正司法鉴定 所完成。 0064 采用克隆幼猫(大蒜-1)的血液DNA为检材1(大蒜-1血)， 代孕母猫的血液DNA(258 血)为检材2， 被克隆猫的体细胞DNA(大蒜细胞)为检材3， 鉴定检材1与检材2之间的DNA亲子 关系， 鉴定检材1与检材3之间的DNA-STR分型同一性关系。 0065 使用feline genotypes STR系统， 用ABI 9700型扩增仪复合扩增STR基因座， 扩增 说明书 6/9 页 8 CN 111718962 A 8 产物利用ABI 3130测序仪进行基因分型检测。 0066 STR分型结果， 不支持检材1(大蒜-1血)与检材2(258血)具有。

　　31、生物学亲子关系； 检 材1(大蒜-1血)与检材3(大蒜细胞)的STR分型相同。 0067 表5检材1(大蒜-1血)、 检材2(258血)、 检材3(大蒜细胞)的STR基因座和性别基因 座的基因分型结果 0068 0069 0070 实施例2： 0071 体细胞的分离培养， 体内成熟获得成熟的卵母细胞， 卵母细胞去核以及供体细胞 准备参见实施例1。 差别仅在于体细胞克隆所用体细胞的供体猫为中华田园猫 “小黄” 和山 东师猫 “BB” 。 0072 在注核、 融合及激活步骤中的融合步骤进行了如下调整： 0073 在细胞中加入1的仙台病毒稀释液重悬细胞， 1000RPM(200g)离心5分钟， 弃去。

　　32、 上清， 用3倍稀释仙台病毒重悬细胞， 冰浴5分钟， 将细胞悬液放入操作液中， 挑选细胞进行 注核， 用注射针轻压透明带， 使体细胞与卵母细胞膜紧密结合构建重构胚。 放入SOF微滴中 培养30分钟， 在体式镜下观察卵母细胞细胞质和供体细胞的融合。 0074 为了提高融合效率， 接着采用0.5mm融合槽进行电融合： 将重构胚用1根不沾油的 说明书 7/9 页 9 CN 111718962 A 9 捡卵针洗净油， 并在融合液中平衡若干时间使复合体沉底， 用枪头吸100 l融合液， 放入电 极槽并吹洗， 再把液吸干(用此方法洗3遍)， 然后放入逐个将复合体放入融合槽的平行电极 之间。 不同的卵用不同。

　　33、的电压， 融合的重构胚采用的电压为约1.0KV/CM， 2个脉冲， 间隔60 s， 进行电刺激。 未融合的胚使每一个体细胞处在12点或6点的位置用电融合设备(BTX)进行 电刺激， 电压为1.6KV/CM， 2个脉冲， 间隔60 s把卵从融合槽中用捡卵针放入HCR液中， 待所 有卵电击完后， 从HCR液中转移到SOF溶液中清洗至少三遍后， 放入SOF微滴中培养30分钟以 后， 再在体式显微镜下将能观察卵母细胞细胞质和供核细胞的融合， 统计融合效率。 判定为 融合的重构胚用含10 g/ml CHX和5 g/ml CB的胚培养液激活4h， 完成激活后进行胚胎移 植。 0075 另外， 胚胎移植步骤。

　　34、还进行了如下调整： 0076 受体猫麻醉后， 选择未冲卵的一侧腹壁侧切， 暴露未冲卵的卵巢组织， 将子宫及卵 巢牵出。 将克隆胚胎吸入胚胎移植管中， 从输卵管伞部插入胚胎移植管， 将胚胎植入受体猫 体内。 通过形态学观察， 确认所有进行注核的卵母细胞均已去核， 胚胎移植过程只移植融合 胚胎， 防止低质量胚胎影响克隆胚胎的着床。 实施例1中没有确认卵母细胞全部去核。 克隆 胚胎移植结果参见下表6和表7。 0077 表6小黄克隆胚胎移植结果 0078 0079 表7 BB克隆胚胎移植结果 0080 0081 0082 7.克隆猫鉴定结果 0083 为确定出生的克隆幼猫与体细胞供体猫(被克隆猫)是否。

　　35、具有相同的遗传信息， 以 及确定其与胚胎移植受体母猫的亲缘关系， 采集克隆幼猫的血液、 代孕母猫的血液及被克 隆猫的体细胞， 采用STR鉴定的方法， 确定克隆幼猫与被克隆猫的同一性关系、 克隆幼猫与 代孕母猫之间的亲子关系。 鉴定结果参见下表8和表9： 说明书 8/9 页 10 CN 111718962 A 10 0084 表8克隆猫小黄和克隆供体同一性比对结果 0085 0086 表9克隆猫BB与克隆供体同一性比对结果 0087 0088 实施例3 0089 采用与实施例2相同的方法还对名称为黄枪枪， 呆呆， 咖啡和公猫四只猫进行了类 似的体细胞克隆， 连同实施例2的克隆效率汇总在下表10中： 0090 表10克隆猫克隆效率统计 0091 0092 可以看出， 通过优化克隆方法， 将克隆猫的平均克隆效率提高到了3.8， 克隆效 率最高的项目 “公猫” 达到了16.7， 相比于实施例1有了显著的进步。 说明书 9/9 页 11 CN 111718962 A 11 。