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　　：动物体细胞克隆也叫体细胞核移植，就是将动物的体细胞经同期化处理后，通过核移植的方法，将体细胞导入除去了染色质的成熟卵母细胞，激活后在体外发育成克隆胚胎并移植到受体动物内，经妊娠后生产出克隆动物的方法。从理论上讲这种方法可以无限制地克隆动物个体，因为分化的各种体细胞核是取之不尽的。克隆羊多莉的诞生是克隆技术发展史上的一个里程碑。它从理论上证明了已高度分化了的动物细胞仍然具有发育成为一个完整生物体的全能性，在适当条件下通过基因组的重新编程就可能发育成为一个新的个体，这对发育生物学、遗传学理论的深入发展已经产生重大的影响。该技术的应用将会带来巨大的经济效益，首先能使遗传性状优秀的个体大量增殖，大大加快动物育种的进程，例如，一头高产奶牛，正常情况下，一生所能生产的母牛头数是很有限的，而且后代不纯；不可能性状全像母亲，既不能保证是高产母牛。一般说来，要培育出一个纯度达98%的品系，需要进行20代的兄妹间交配。在牛，这就意味着需要100年的时间。而且，长时间的近亲交配会导致生育能力的明显降低。此外，一群体内的遗传优秀个体的迅速增殖可导致快速的遗传进展。其次，可用来作为培育转基因动物的生产平台，提高转基因动物的效率。第三可以预先选定克隆后代的性别，对于需要特定性别的动物家畜产业具有重要的实践意义。第四可以用于珍稀和濒危动物的扩繁和保种，第五满足生物医学研究对实验动物的特殊需要，可大大减少实验动物的数量，而且能提高实验的准确性，此外，以此技术为基础还为分子生物学、发育生物学、再生生物学等学科提供了独一无二的研究平台，其中治疗性克隆技术的建立为医学的发展开辟了一个全新的领域。尽管体细胞克隆技术有着十分巨大的意义和经济效益，但从目前看该技术还远不完善，要想使体细胞克隆牛的制备达到工厂化和商品化大规模生产，还有一系列的问题需要克服，主要是培育克隆动物的总体效率仍然很低，据报道目前国际上克隆总体效率低于5%。这主要表现在流产率高，体细胞克隆动物的流产率达40%—100%，在怀孕的牛中还有相当多的牛表现出羊水过多，胎儿体形过大导致胎死腹中；另外出生死亡率高，平均只有一半的新生克隆个体可以存活下来，这些都是导致克隆效率低的主要原因。从目前结果看，克隆动物胎儿的胎盘发育不正常是导致克隆动物流产和死亡的一个重要原因。与正常动物胎儿的胎盘进行比较，可观察到克隆动物的胎盘普遍存在胎盘过大，以小鼠为例克隆小鼠的胎盘平均比对照组大约30%。另外克隆动物胎盘的子叶数量明显偏多，且子叶个体大，以牛为例，克隆牛的胎盘中子叶的数量比对照组少了1/3—1/2，而且子叶的个体明显偏大，通过对克隆动物胎盘和子叶的组织学观察也发现与对照组有明显的不同。研究表明克隆牛胎儿的胎盘上基因的表达，特别是印记基因的表达不很正常，是导致克隆胎盘发育不正常的重要原因。通过对移植到受体内的克隆胚胎跟踪观察发现在移植后大部分胚胎可以着床和发育，妊娠率与体外授精(IVF)胚胎相比并没有太大差别，但2-3个月后有40%的胎儿流产，在未流产的胎儿中也有大约l/3胎儿发育明显迟，最终导致胎儿死亡，在能继续发育的胚胎中，还有相当多的受体存在羊水过多或巨胎现象，以上情况都说明克隆动物胎儿与母体之间的物质运输存在很大的问题，本实验室在制备克隆牛的过程中也多次发现因为胎盘溃烂致使克隆牛胎死腹中的情况，可见胎盘发育异常是导致克隆动物发育失败的重要原因。这主要是在体细胞克隆过程中，供体细胞核没有能够完全重编程或表现遗传修饰发生改变而造成的。在胚胎发育到囊胚后，胚胎会分化为滋养层细胞和内细胞团细胞，前者发育成为胎盘，后者发育成胎儿，在发育成胎盘的细胞中，主要由4倍体和双核细胞组成。

　　本发明的目的是提供一种动物体细胞克隆方法。本发明所提供的动物体细胞克隆方法，是将经体外受精得到的处于8-16细胞期的4倍体卵裂球移入8-16细胞期的体细胞克隆胚内得到复合胚，培养该复合胚得到克隆动物。所述动物具体可为牛。其中，所述4倍体卵裂球可按照如下方法得到将由体外受精卵分裂到2细胞期的胚胎进行融合得到4倍体细胞，培养该4倍体细胞至8-16细胞期，得到处于8-16细胞期的4倍体卵裂球。所述4倍体卵裂球具体可处于8细胞期，所述体细胞克隆胚具体可处于8细胞期。受精卵的合子核和体细胞核不仅在结构上存在巨大差异，而且在基因表达模式上，胚胎细胞和体细胞也完全不一样。虽然在动物体细胞克隆过程中，体细胞核在重构胚中进行了去分化和再分化的重编程过程，大多数重构胚在发育早期的核重编过程不完全，尤其是甲基化明显不足，特别是胎盘在克隆动物中普遍存在基因表达异常，使其失去支持胚胎发育的重要功能，直接导致克隆胚胎的流产和胎儿发育障碍。由于受精而形成的合子其细胞核的基因表达和后成修饰均正常，具有完全的功能，本发明将体外受精后分裂到2细胞期的胚胎经过电击再次融合形成4倍体细胞，再培养到8-16细胞期后，将细胞取出移入到8-16细胞期的早期克隆胚内形成复合胚。经过发育即可使克隆胚细胞数量有明显增加，又可以改变胚胎质量，从而提高克隆效率。本发明的动物体细胞克隆方法的流程如图l所示。本发明创造性地改变滋养层细胞的来源，将4倍体的体外受精(IVF)的卵裂球放入到8-16细胞期的克隆胚胎内，使其能够发育成为滋养层细胞，进而改善胎盘的质量，改善胎儿发育条件，提高了克隆胚胎的妊娠率，降低流产率和难产率，从而大大提高了体细胞克隆效率。由于胎儿是由2倍体细胞构成，4倍体卵裂球细胞只能形成胎盘而不具有发育成为胎儿的可能性，所以用此方法将不会对克隆动物造成影响。图1为本发明的动物体细胞克隆方法的流程示意图图2为转GFP基因的8-cells期四倍体卵裂球(4n)移入8细胞期克隆胚内，重构胚发育过程图3为pEGEP-Nl的物理图谱具体实施例方式实施例l.克隆牛1.供体——四倍体卵裂球(4n)的制备1.1卵母细胞体外成熟屠宰厂收集成年黄牛的卵巢放入3(TC的生理盐水在4小时内送到实验室，将卵巢在37。C的PBS液中洗三遍后取出放一容器内，选择直径为4-8ram的卵泡用10ml注射器18号针头吸取卵泡液，对回收的卵母细胞进行分类，选择带有三层以上卵丘致密的A类卵丘卵母细胞复合体，用成熟液洗涤3遍(成熟液为M199+10%FBS+0.01U/mLbFSH+0.OlU/mLbLH+l^g/mL雌二醇)，然后将卵丘卵母细胞复合体放入成熟液滴中30-40枚/滴，在38.5C5。/。C02培养箱中培养成熟22hrs。1.2冻精的化冻及体外获能取北京市奶牛中心荷斯坦牛的冻精于38.5C水浴30秒化融，将精液滴入预温(38.5°C)的Percoll梯度离心液(45。/。900/0)中于离心机中分离活精子(2000转/分钟，8min)，弃上清液，用预温的BO液吹洗精子，离心(1800转/分钟，8min)，弃上清液，用B0液悬浮精子。1.3卵母细胞体外受精(invitrofertilizationIVF)及体外培养把成熟的卵母细胞放入受精液滴(B0液+25Pg/mLh印arin十10mg/mLBSA)中15-20枚/滴，加入已获能的精子(使密度为1.0X106个/ml)，在38.5°C5%C02培养箱中共孵育8-10hrs，将共孵育后的卵母细胞放入离心管内振荡2-3分钟脱去颗粒细胞，选取形态较好的假想合子放在KSOM液滴中15-20枚/滴，38.5°C，5%0)2培养箱培养。1.4四倍体卵裂球(4n)的制备在合子培养18-24hrs的过程中(6hrs内)选择分裂形态好的2细胞期胚胎，将其放入融合液(PBS+0.3M甘露醇+0.15慮CaCl2+0.15mMMgS04)中平衡(现用现配)3-5分钟后放入融合槽内，转动胚胎使其2个卵裂球与电场垂直，同时给出1.5Kv/cm的直流脉冲l个，脉冲时间为4(ms(ECM-2001BTX)融合后迅速将重构胚移入KS0M液中培养1小时后，选取融合的4n胚胎进行激活(乙醇+6-DMAP联合激活M199+7%乙醇激活5min后，M199+1.9mmol/L6-DMAP激活5hrs)，再将激活的4n胚胎放在KS0M液中培养48hrs。2.胚胎受体——体细胞克隆胚胎的制备2.1体细胞克隆核供体的准备选定荷斯坦奶牛的成纤维细胞系作为供核体细胞系，该细胞系按照如下方法制备剪取牛耳组织样，并将其剪碎成lmm3左右的小块，DMEM/F12清洗2次后分批植块于含6mLDMEM/F12+10%FBS的25cm2的培养瓶中，于37。C，5%C02培养箱培养6-7天，每2天换液l次，待细胞生长汇合后，以O.1%胰蛋白酶消化并传代培养。取F3-F10代供核体细胞用于核移植试验，待细胞生长至汇合后，将培养液(DMEM/F12)中FBS降至0.5%对细胞进行血清饥饿处理，在37.5°C5%0)2箱中培养3-4天后，细胞用作核供体进行核移植操作。2.2卵母细胞的成熟培养屠宰厂收集成年黄牛的卵巢放入3(TC的生理盐水在4小时内送到实验室，将卵巢在37。C的PBS液中洗三遍后取出放一容器内，选择直径为4-8ram的卵泡用lOml注射器18号针头吸取卵泡液，对回收的卵母细胞进行分类，选择带有三层以上卵丘致密的A类卵丘卵母细胞复合体，用成熟液洗涤3遍(成熟液为M199+10%FBS+0.01U/mLbFSH+0.01U/mLbLH+lPg/mL雌二醇)，然后将卵丘卵母细胞复合体放入成熟液滴中30-40枚/滴，在38.5°C5%0)2培养箱中培养成熟22小时。2.3卵母细胞的去核在38.5°C5%0)2培养箱中培养成熟18小时后，将成熟的卵母细胞放入0.1%透明质酸酶的管内振荡2-3分钟后，再用玻璃管轻轻吹打卵母细胞使其卵丘与卵母细胞完全脱离，挑选形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体。将带有第一极体的卵母细胞移入含M199+10%FBS+7.5Pg/mL细胞松驰素B的操作液中，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20陶的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入M199+20%FBS的溶液中洗三遍后，置于培养箱中备用。2.4移核与融合将血清饥饿4天的供体细胞用0.1%胰蛋白酶消化3-4分钟，选择形态好的细胞作为核供体。用外径20Pm的玻璃管将其移入去了核的卵母细胞透明带内，并使供体细胞与卵母细胞膜紧密接触，然后将其放入融合液(PBS+0.3M甘露醇+0.15mMCaCl2+0.15mMMgS(U中平衡(现用现配)3-5分钟后放入融合槽内，转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触而与电场垂直，同时给出2.5Kv/cm的直流脉冲2个，间隔1秒钟，脉冲时间为10Ps(ECM-2001BTX)融合后迅速将重构胚移入M199+10%FBS液中培养l小时后，挑选融合胚进行下一步激活处理。2.5激活与培养将重构胚放入5Wnol/L离子霉素液中，4min后换到1.9mmol/L6-DMAP液中，4hrs后再移入CRlaa液，38.5°C，5%0)2培养箱中培养48hrs。3.(体细胞克隆胚+四倍体)复合胚胎的制备3.1四倍体卵裂球的准备经培养48hrs后，选取分裂形态好的8-cells期4n，用5mg/ml链霉蛋白酶消化其透明带，将脱去透明带的4n放置于无钙镁PBS中，平衡2min后轻轻吹打胚胎使卵裂球分离开。3.2(体细胞克隆胚+四倍体)嵌合胚胎的制备及培养待体细胞克隆胚胎培养48hrs后，选取分裂形态好的8-cells期胚胎作为受体胚胎；将上述分离得到的单个8-cells期四倍体卵裂球用外径35Pm的玻璃针移入体细胞克隆胚内，移入CRlaa+5y。FBS液，38.5°C5%002培养箱中培养，7天后合计胚胎个数，并用1Pg/mLHoechst33342对胚胎进行染色以荧光显微镜观察记数囊胚细胞数，并分析嵌合胚的囊胚发育率。将形态优良的第7天囊胚移入同期的受体牛(荷斯坦牛)的子宫角内，2-3枚/头次，共移植15头次。在移植后的第60天进行直肠检测以确定妊娠率。对妊娠母牛按常规饲养方法进行饲养，经过280天，妊娠母牛分娩，统计出生小牛头数、出生体重和存活率。对于作为对照的普通克隆胚组，将步骤2.1至2.5获得的克隆胚移入CRlaa+5%FBS液，38.5°C5%0)2培养箱中培养，7天后合计胚胎个数，并用lPg/mLHoechst33342对胚胎进行染色以荧光显微镜观察记数囊胚细胞数，并分析囊胚发育率。将形态优良的第7天囊胚移入同期的受体牛(荷斯坦牛)的子宫角内，共移植14头牛。在移植后的第60天进行直肠检测以确定妊娠率。对妊娠母牛按常规饲养方法进行饲养，经过280天，妊娠母牛分娩，统计出生小牛头数、出生体重和存活率。对于作为对照的IVF组，将步骤1.3获得的合子放在KS0M液滴中15-20枚/滴，38.5°C，5%(:02培养箱培养，7天后合计胚胎个数，并用lPg/mLHoechst33342对胚胎进行染色以荧光显微镜观察记数囊胚细胞数，并分析囊胚发育情况。数据用SPSS统计软件6tee^7^7ora做方差分析，结果如表l。结果表明嵌合胚(复合克隆胚)组与普通克隆胚组和IVF组囊胚率无显著性差异(44%m.43%36%，尸,ft05)，但以嵌合胚(复合克隆胚)组最高；经胚胎染色记数发现嵌合胚(复合克隆胚)细胞数显著高于普通克隆胚组(123土3287±41，/YftW)，而嵌合胚(复合克隆胚)组接近于IVF组(139±22);出生的3头来自嵌合胚(复合克隆胚)的克隆牛全部成活，且体重均正常，分别为39kg，42kg,45kg。出生的3头来自普通克隆胚组的克隆牛只有l头成活，体重正常，为38kg。表l.tabletableseeoriginaldocumentpage9/column/rowtable实施例2、4倍体的体外受精(IVF)的卵裂球放入到8-16细胞期的克隆胚胎内发育成为滋养层细胞为图示说明此过程，将带有转有增强绿色荧光蛋白(EGFP)的克隆卵裂球作为标记信号代替普通IVF卵裂球，具体操作如下，图示如图2:将含有EGFP基因的质粒pEGEP-Nl(GibcoBRL公司，目录号6085—1)转入按照实施例1步骤2.l制备荷斯坦奶牛的成纤维细胞系中，作为供核体细胞系，按照实施例1的步骤2.1-2.5激活后分裂至2细胞期，再将其按照实施例1的步骤1.4获得四倍体卵裂球(4n)，并培育至8-cells期。将该转EGFP基因的8-cells期四倍体卵裂球(4n)按照实施例1的方法移入按照实施例1的步骤2制备的8细胞期克隆胚内。结果表明将转EGFP基因的8-cells期四倍体卵裂球(4n)移入8细胞期克隆胚内，重构胚发育过程中可见带有EGFP绿色荧光的卵裂球将渐行迁移至囊腔上并最终形成滋养层细胞(图2)。图2中A.48hrs(起始时间从重构胚放入培养液培养开始算起)将带有EGFP绿色荧光的卵裂球移入8细胞期克隆胚胎；B.144hrs(起始时间从重构胚放入培养液培养开始算起)带有EGFP绿色荧光的卵裂球分裂增殖，荧光信号增强；C.和D.为孵化后带有EGFP绿色荧光的滋养层细胞扩散至囊腔表层。pEGEP-Nl的物理图谱如图3所示，EGFP为绿色荧光蛋白基因，NE(r为新霉素抗性基因，pCMV-IE为CMV-IE启动子，pSV40为SV40启动子。权利要求1、一种动物体细胞克隆方法，是将经体外受精得到的处于8-16细胞期的4倍体卵裂球移入8-16细胞期的体细胞克隆胚内得到复合胚，培养该复合胚得到克隆动物。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述动物为牛。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述4倍体卵裂球按照如下方法得到:将由体外受精卵分裂到2细胞期的胚胎进行融合得到4倍体细胞，培养该4倍体细胞至8-16细胞期，得到处于8-16细胞期的4倍体卵裂球。4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述4倍体卵裂球处于8细胞期，所述体细胞克隆胚处于8细胞期。全文摘要本发明公开了一种动物体细胞克隆方法。该动物体细胞克隆方法，是将经体外受精得到的处于8-16细胞期的4倍体卵裂球移入8-16细胞期的体细胞克隆胚内得到复合胚，培养该复合胚得到克隆动物。本发明创造性地改变滋养层细胞的来源，将4倍体的体外受精(IVF)的卵裂球放入到8-16细胞期的克隆胚胎内，使其能够发育成为滋养层细胞，进而改善胎盘的质量，改善胎儿发育条件，提高了克隆胚胎的妊娠率，降低流产率和难产率，从而大大提高了体细胞克隆效率。由于胎儿是由2倍体细胞构成，4倍体卵裂球细胞只能形成胎盘而不具有发育成为胎儿的可能性，所以用此方法将不会对克隆动物个体本身造成影响。文档编号C12N5/06GK101182489SQ公开日2008年5月21日申请日期2007年11月19日优先权日2007年11月19日发明者丁方荣,颖刘,戴蕴平,京李,宁李,松李,荣李,王海平,王莉莉申请人:戴蕴平;李宁;北京济普霖生物技术有限公司

　　技术研发人员：戴蕴平;李宁;刘颖;王莉莉;王海平;李荣;丁方荣;李京;李松

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