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　　1、克隆原理和方法主要内容一、概述二、胚胎分割三、细胞核移植一、概述克隆（clone）是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称为无性繁殖。通常，将所有以非受精方式繁殖获得的动物均称为克隆动物，将产生克隆动物的方法称之为克隆技术。动物克隆技术包括4孤雌激活生殖广义狭义动物克隆技术卵裂球分离与培养胚胎分割细胞核移植亦称单性生殖，雌性个体产生的卵,无需受精,可发育成新雌性个体。把哺乳动物早期胚胎分离成单个卵裂球，再把卵裂球单独培养为正常胚胎，然后移植给受体得到克隆后代。二、胚胎分割（embryo splitting）胚胎分割：利用机械或化

　　2、学方法人为地将一个植入前的胚胎分割成两个或多个部分，然后在适宜条件下进行体外培养、移植到受体子宫或输卵管（或不经过培养直接移植），从而人工制造同卵双生或同卵多生的技术。56 胚胎分割的理论依据：是早期胚胎的每一个卵裂球都具有独立发育成个体的全能性。采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。.具有全能性二、胚胎分割1.发展概况 在20世纪30年代，Pincus等，首次证明2-细胞胚的单个卵裂球在体内可以发育成体积较小的胚泡。Tarkowski等（1959）进一步证明哺乳动物2-细胞胚的每一个卵裂球都具有发育成正常胎儿的全能性。20世纪70年代以来，Mullen等（1970）通过分离小

　　3、鼠2-细胞胚胎卵裂球，获得同卵双生后代。Moustafa（1978）将小鼠桑椹胚一分为二，也获得同卵孪生后代。Willadsen（1979）分离早期胚胎的卵裂球，成功地获得了绵羊的同卵双生后代。7二、胚胎分割1.发展概况（续）张涌等（1987）通过分割山羊早期胚胎，均获得了同卵双生后代。窦忠英等（1992）将7日龄的牛胚胎一分为四，实现了同卵三生。目前，获得二分之一胚胎后代的动物有小鼠、家兔、绵羊、山羊、牛、马和人；获得四分之一胚胎后代的动物有家兔、绵羊、猪、牛和马；获得八分之一胚胎后代的畜种有家兔、绵羊和猪。值得说明的是，随着胚胎分割次数的增多，分割胚胎的发育能力明显降低，这可能与胞质的不断

　　4、减少有关。8二、胚胎分割2.胚胎分割的程序与方法 胚胎分割方法：（1）显微操作仪分割（2）徒手分割9实体显微仪显微操作仪二、胚胎分割2.胚胎分割的程序与方法（续）分割好的半胚应完全分离，可分别装入空透明带内，也可不装入透明带移植。分割桑椹胚无方向性，而囊胚则必须沿着等分内细胞团的方向分割。10牛性别鉴定胚胎分割示意图11二、胚胎分割3.胚胎分割技术的应用（1）可增加胚胎数目，人造同卵双胎和多胎，移植后便可获得更多的良种。（2）可按需要从一个胚胎切出一部份用作性别鉴定、生产性能测定、冷冻保存或遗传病诊断。12三、细胞核移植（cell nuclear transfer）1.细胞核移植概念狭义的克隆

　　5、即指细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使卵子不依靠精子、而通过人为方式被激活、分裂并发育成新的个体，使核供体的基因得到完全复制。13三、细胞核移植2.细胞核移植的机理 供体细胞的细胞核移入卵母细胞后，在卵母细胞相关因子的作用下，发生了重编程回复到发育的起点状态。核重编程的过程就是使在体细胞中被关闭，而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程。供核重编程可能的结果：供核基因组完全没有进行重编程重构胚很快死亡部分重编程，重构胚在不同的发育阶段死亡完全重编程，产生正常的克隆动物1415供体细胞核的来源胚胎干细胞核移植异种核移植同种核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植供受体种间关系

　　6、三、细胞核移植3.核移植技术的分类三、细胞核移植4.研究历史与现状 1938，Spemann提出将胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中构建新胚胎的设想。1952，Briggs等将蛙胚细胞核移入核失活后的受精卵中并发育成个体，首次在两栖动物上获得成功。1958年到1962年，英国剑桥大学利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。1981，Illmensee等用微玻璃吸管将小鼠囊胚内细胞团（ICM）和胚外层细胞核注入除去雌、雄原核的受精卵内，然后移植到假孕小鼠的输卵管中，首次获得了克隆小鼠。迄今为止，已在绵羊、牛、兔、猪和山羊等动物获得胚细胞克隆后代。16三、细胞核移植4.研究历史与现状（续）

　　7、1997年2月，Wilmut等将来自6岁绵羊的乳腺细胞核移入去核卵母细胞后，得到了世界上第一头体细胞克隆哺乳动物、即“多莉”羊，首次证明了成熟的体细胞也具有全能性。这是生物学史上的里程碑。17克隆羊“多莉”的培育18多莉羊Ian Wilmut 19克隆羊“多莉”羊 科学家取一头普通白绵羊的乳腺细胞，将细胞核移植到一个剔除了细胞核的卵子中，使之融合、分裂、发育成胚胎，然后移植到第三头羊的体内。科学家共培育277个胚胎，只有多莉成功出生。1996年7月5日，多莉降临人世。直到1997年2月23日才公布于众。2003.2.14日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，

　　8、人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊”。19克隆羊“多莉”的培育三、细胞核移植4.研究历史与现状（续）自体细胞核移植羊成功以来，用胎儿体细胞和成年动物体细胞进行核移植的研究发展十分迅速，核移植研究从胚胎细胞核移植转入了体细胞核移植研究阶段，所使用的供体细胞也越来越广泛，并已在牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡、马、大鼠、水牛和犬等动物上获得克隆后代。20三、细胞核移植4.研究历史与现状（续）1999年，小鼠胚胎干细胞（ESC）克隆获得成功，用长期培养的牛（原始生殖细胞）PGCs克隆后获得了一头公牛。2000年，西北农林科技大学成功获得成年体细胞克隆山羊，标志着我国动物体细胞克隆技术的崛起。2001-

　　9、2004年，山东莱阳农学院、中科院动物所、中国农业大学等相继获得几十头体细胞克隆牛出生。2007年，广西大学利用水牛的胎儿成纤维细胞和颗粒细胞为核供体，克隆成功了3头水牛。21三、细胞核移植4.研究历史与现状（续）1998，Wells等利用异种体细胞克隆获得了一头名为“贵妇”的珍稀母牛。2001，Loi等将濒危动物欧洲盘羊的颗粒细胞核移入绵羊的去核卵母细胞中，重构胚发育到囊胚后移植到受体绵羊子宫角，有2只妊娠，其中1只产下了1只正常的欧洲盘羊。1999，中科院陈大元等获得大熊猫异质克隆囊胚。将大熊猫的体细胞核植入去核后的兔卵细胞中，成功地培育出了大熊猫的早期胚胎。2001，广西大学谭世俭等进行

　　10、了水牛和黄牛胚胎细胞核移植获得种间核移植囊胚。22三、细胞核移植4.研究历史与现状（续）与此同时，克隆技术与转基因技术、胚胎干细胞（ESC）技术相结合，拓宽了应用范围。1997，Schnieke等在Nature上发表了利用克隆技术获得转基因羊的结果；1998，Cibelli等也用类似方法获得转基因克隆牛；2000，Mc Creath等首次获得了基因打靶的克隆羊；2000，Munsie等从小鼠体细胞核移植囊胚中分离得到了小鼠ES细胞，从而拉开了治疗性克隆研究的序幕。23三、细胞核移植4.研究历史与现状（续）2001，美、意科学家联手展开克隆人的工作。2001.11，美科学家宣布首次克隆成功了处于

　　11、早期阶段的人类胚胎，称其目的是为病人“定制”出不会诱发排异反应的人体组织器官，用于移植。2004.2.11，美国 科学 杂志宣布，汉城国立大学研究小组成功克隆出人类早期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。由于法律的限制，人的克隆仅限于治疗性克隆。24三、细胞核移植5.细胞核移植技术程序2525细胞核移植技术程序激活、培养、移植或重复克隆重组胚融合受体细胞去核核卵重组供体核分离2626供体核分离供体细胞的种类与准备供体喜胞周期的调控胚细胞体细胞ES细胞若处于G2或S期,因DNA复制形成多倍体而死亡若处于G0（生长停滞期）或G1期效果好常采用血清饥饿法处理，使细胞周期停滞在G0期或G1期从2-细胞至IC

　　12、M细胞，均可用作供体细胞。一般选1632细胞期胚胎。用0.2%链霉蛋白酶预处理早期胚胎，然后机械剥离透明带，用钝头玻璃管反复吹吸以分离成单个卵裂球采用G0/G1期的细胞作为核供体是理想的供体细胞，但也需要进行细胞周期的调控生殖系统的细胞胎儿的细胞成体除生殖系统以外的细胞终末分化的细胞5.细胞核移植技术程序（1）供体核分离5.细胞核移植技术程序（1）供体核分离（续）常用的体细胞有：皮肤成纤维细胞卵丘细胞或卵泡颗粒细胞：克隆效果最好。因其具有自然静止在G0/G1期、存在与卵紧密联系的胞质微绒毛桥、端粒酶活性高等优点。275.细胞核移植技术程序（2）受体细胞去核 受体细胞一般均采用超数排卵回收的卵母

　　13、细胞或体外培养成熟的卵母细胞（MII期）。将其置于含细胞松弛素B（CB）和秋水仙胺的培养液中去核。受体细胞去核方法：盲吸法透明带切开法微分干涉和极性显微镜去核法28MII期卵母细胞PB15.细胞核移植技术程序（2）受体细胞去核盲吸法（一步法）：刚成熟的MII期卵母细胞的核总是处于PB1附近，所以以第一极体为指示，吸去PB1和其下方1/41/3的胞质，就可以去核。盲吸法与DNA染色示踪核位置相结合，既能达到100%的去核，又能避免紫外线照射损伤卵母细胞。此法主要适用于牛、羊。29PB1PB1核5.细胞核移植技术程序（2）受体细胞去核30透明带切开法 先用固定管吸住卵母细胞，用切口针拨动使PB1位

　　14、于12点钟位置，从上部刺入并经PB1基部刺穿对侧透明带，切开透明带1/4l/5。去核：直接去核：用平头吸管自切口处插入，连同PB1及其下方约1/41/3胞质一同吸出。适用于小鼠。挤压法去核：将PB1重新固定于6或12点钟位置，用平头吸管自固定管对侧挤压卵，挤出PB1及其下方部分胞质。该法适用于牛。挤压法去核5.细胞核移植技术程序（2）受体细胞去核微分干涉和极性显微镜去核法：对于一些脂肪颗粒含量较少的卵母细胞（如小鼠），在微分干涉相差显微镜下可观察到染色体，可直接去核。对于脂肪颗粒含量较多的卵母细胞（如牛和猪），在极性光学显微镜的基础上研制出一种纺锤体图像观察系统（spindle-view），可

　　15、直接观察到卵母细胞的纺锤体，从而可准确地对卵母细胞去核。31spindle-view系统去核法5.细胞核移植技术程序（3）注核32 注核部位通常为卵周隙或胞质。卵周隙注射：在显微操作仪操纵下，用去核吸管吸取一枚分离出的完整卵裂球或体细胞，沿透明带切口插进，反吸一点胞质，一起注入去核卵的卵周隙内。适用于体积较大的供体细胞。胞质内注射：先将供体细胞的核膜捅破，形成核胞体，再将核胞体直接注入到去核卵的细胞质中，然后进行激活处理，也称“檀香山”技术。适用于体积较小（20m）的供体细胞。33卵周隙注射胞质注射5.细胞核移植技术程序（4）重组胚的融合 通常先将供体细胞注入到卵周隙中，然后进行融合。融合的方

　　16、法主要：仙台病毒法 将仙台病毒与供核体一起注入受体卵中，促进细胞融合。该法成功率高，胚胎发育良好，但由于实验室很难同时保持该病毒高的融合力与低的毒性，故现已很少采用。电融合法 将重组胚直接放在融合小室内，使核质接触面与电流方向相垂直，在一定的电场强度下，给予一定时间的直流电脉冲，依靠直流脉冲使细胞膜产生可逆性的微孔，进而导致融合。此法现最常用。3435重组胚的电融合过程5.细胞核移植技术程序（5）核移植胚的激活、培养、移植或重复克隆 正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后，卵母细胞质中会出现一系列的反应，如游离Ca2+浓度增高、母源性的mRNA启动转录、成熟促进因子（MPF）等因子活性下降等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过这些变化，胚胎就不能正常发育。核移植过程中的激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。重组胚的正常发育有赖于卵的充分激活。365.细胞核移植技术程序（5）核移植胚的激活、培养、移植或重复克隆（续）常用的激活方法有化学激活和电激活两种：化学激活剂有：乙醇、离子霉素、A23187、6-DMAP、Staurosporine和SrCl2等。电激活根据其在核移植前或后进行而Kaiyun平台 官方入口Kaiyun平台 官方入口