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　　IU/mL，透明质酸酶100IU/mL)振荡消化h，收集悬液离心后，用D-

　　10μg/mL，氢化可的松5μg/mL)调整密度至4×105个/mL接种于六孔

　　+ %EDTA 消化3 min 后， 弃去含脱壁成纤维细胞的消化液， 重新加入培

　　特异性表达载体(图1)， 经QIAEX 试剂盒回收后溶于超纯水中， ?20 oC 保

　　催乳素(5 μmol/L)诱导人乳铁蛋白的表达， 48 h 后收集培养液迚行SDS-

　　于发情后第9~13 天开始超排。连续3 d 注射FSH， 每天2 次， 总剂量

　　48 h，Kaiyun平台 官方入口 于核移植前2 h 胰蛋白酶消化处理， 用M2 悬浮细胞备用。卵母细

　　胞在注射LHRH 后26~30 h 输卵管手术冲取， 用透明质酸酶消化并吹打去

　　处理20 min， 在荧光下确定纺垂体位置并去核， 同时吸取中等大小光滑的

　　M16 中培养30~60 min 后观察， 未融合卵按以上条件重复1 次。融合卵

　　兊隆羊鉴定采用 PCR+RFLP(限制酶片段多态性分析)的方法[11]。扩增

　　供核细胞羊基因组DNA。以样品DNA 为模板迚行PCR 扩增， 第1 轮以

　　1)、2)为引物， 迚行10 个循环; 用扩增产物为模板再加入1)、3)引物迚行

　　第2 轮扩增， 30 个循环。PCR 产物经a I 酶切、10%聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　G418 抗性筛选14 d 后，共挑取54 个单兊隆扩增传代， 细胞诱导液

　　经Western blotting 检测， 其中有16 孔的单兊隆细胞表达的重组乳铁蛋

　　白不人乳铁蛋白相似， 分子量约为75 kD(图3)，PCR 检测结果证明均成功

　　如表1 所示， 共融合156 枚重构胚， 融合率为%; 激活后的144 枚重

　　构胚短暂培养后移入16 只同步发情受体输卵管中， 在移植后的30 d、60

　　d 和 90 d 迚行B 超诊断， 妊娠率分别为%、%和%; 3 只受体妊娠足月生下

　　3 只兊隆羊，产羔率为%， 共4 只受体在怀孕过程中流产， 其中2 只流产

　　隆羊、Kaiyun平台 官方入口寄母羊和供核羊基因组DNA， 采用PCR+RFLP 的方法分析表明，

　　Neor 基因而产生抗性的细胞分泌基因产物到培养液中， 使其周围或接触的

　　是经过基因转染和G418 长期筛选条件下获得的， 但重构胚的融合率(%)、

　　[8，18]， 高于用转基因胎儿成纤维细胞的结果[7，19]，从而在一定程度上

　　基因动物的供核细胞。在14 只怀孕受体羊中， 有10 只流产或胎儿吸收发

　　生在妊娠后期(60 d)， 且流产胎儿器官发育异常， 不其他报道的结果一

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