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　　克隆是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。动物克隆方法主要有两种，一是胚胎分割；二是细胞核移植。胚胎分割技术克隆胚胎一次只能得到1-4个克隆，因此潜力有限。细胞核移植技术是动物克隆的主要手段，通常所说动物克隆技术是指动物细胞核移植克隆动物的技术。用于核移植的动物细胞又分两种，一是来自早期胚胎，即胚胎细胞；二是来自成体动物的各种组织，即体细胞。

　　2、陈 清 轩.克隆动物简介.中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京100080

　　3、袁玉国,丁国梁,安礼友,赵俊辉,曹玉娟,缪明星,成勇.以经过转染的乳腺上皮细胞生产克隆羊.扬州大学兽医学院江苏省转基因动物制药工程研究中心,扬州225009

　　出生的3只克隆羊表型为黑白花色,与供核羊表型一致。分别Kaiyun官网 登录入口提取克隆羊、寄母羊和供核羊基因组DNA,采用PCRRFLP的方法分析表明,克隆羊条带与供核羊一致,而与寄母羊不同,从而证明克隆羊来自于供核羊细胞(图5、图6)。

　　目前已有多种类型的体细胞用来生产克隆动物。但是,用乳腺上皮细胞为供核细胞生克隆羊研究的报道较少,至今还没有出生克隆山羊的相关报道。并且,乳腺上皮细胞作为转基因小鼠的替代品,可用来评估目的基因在转基因克隆动物中的表达效率,若结合其他适当的筛选方式,以诱导表达目的蛋白的转基因乳腺上皮细胞为供核细胞,能提高生产转基因动物的效率和降低成本。本实验以表达人乳铁蛋白的转基因乳腺上皮细胞系进行核移植,共生产了3只克隆羊,从而在国内外首次证明山羊乳腺上皮细胞经过转染和长期筛选的条件下,能保持发育的全能性,为应用乳腺上皮细胞生产转基因克隆动物提供了一定的实验依据。在G418抗性筛选过程中,整合Neor基因而产生抗性的细胞分泌基因产物到培养液中,使其周围或接触的非整合细胞获得抗性而存活下来。因此,在挑选克隆时很难获得高度纯化的转基因细胞,使得在转基因克隆中,利用抗性细胞生产的克隆动物并非全部整合外源基因。在本实验过程中也存在同样的情况,出生的3只克隆羊没有检测到外源基因,其原因可能是在挑选单克隆细胞时混有多量的非整合细胞在G418筛选后存活,使得在核移植时挑选用的供核细胞为非整合细胞,从而导致出生的克隆羊没有整合外源基因。在以后实验中,考虑结合荧光蛋白标记基因筛选转基因细胞来提高生产转基因动物的效率。本研究中山羊乳腺上皮细胞表达的人乳铁蛋白分子量约为75 kD,与标准分子量有一定差异,这可能是基因整合到细胞染色体中,由于受到细胞内核酸酶等影响,使得表达产物在加工、分泌和运送到胞外过程中受到影响,导致乳铁蛋白的分子量变小,这种现象在其他重组蛋白的表达研究中也经常发生。胎儿成纤维细胞由于生长快、易分化等特点而被广泛用作转基因动物的供核细胞[5-8]。本实验用的供核细胞是来自泌乳期的山羊乳腺上皮细胞,是经过基因转染和G418长期筛选条件下获得的,但重构胚的融合率(64.7%)、怀孕率和克隆效率(2.1%)都较高,与用胎儿成纤维细胞获得的结果相差不大[8,18],高于用转基因胎儿成纤维细胞的结果[7,19],从而在一定程度上表明山羊乳腺上皮细胞同样具有和胎儿成纤维细胞相近的优点,可用于转基因动物的供核细胞。在14只怀孕受体羊中,有10只流产或胎儿吸收发生在妊娠后期(60 d),且流产胎儿器官发育异常,与其他报道的结果一致。总之,本实验表明山羊乳腺上皮细胞经过长期培养筛选后,能保持发育全能性,且重构胚的融合率、怀孕率和克隆效率都较高,可为制备转基因动物提供另一种供体细胞的选择。

　　内容提要：体细胞克隆技术是指把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态。采用核移植的方法，利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体，将后者移入前者中，构建重组胚，供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育过程，妊娠产仔，克隆出动物的技术，又可称之为体细胞核移植技术。比如克隆绵羊“多利”，它是利用细胞拆和技术将成熟母绵羊乳腺细胞核取出并导入到另一只母绵羊的去核卵细胞，再将这个基因已被“调包”的卵细胞放电激活，使其开始像正常的受精卵那样进行细胞分裂；Kaiyun官网 登录入口当细胞分裂进行一定连阶段、胚胎已经形成后，再将这个胚胎植到第三只母绵羊，经过正常的妊娠后产下“多利”。

　　冷冻乳腺上皮细胞解冻后培养至80%汇合后,在0.5% FCS培养液中饥饿48 h,于核移植前2 h胰蛋白酶消化处理,用M2悬浮细胞备用。卵母细胞在注射LHRH后26~30 h输卵管手术冲取,用透明质酸酶消化并吹打去除颗粒细胞。

　　激活后培养的胚胎手术法移入同步发情受体的输卵管内,每只受体移植4~15枚胚胎,在胚胎移植后30 d、60 d和90 d进行B超诊断妊娠情况。

　　在冷冻细胞同时,每孔留一半扩增至80%的丰度后,在培养液中加入催乳素(5 μmol/L)诱导人乳铁蛋白的表达, 48 h后收集培养液进行SDS-PAGE电

　　泳和Western blotting检测。收集经过诱导的细胞,提取DNA进行PCR检测,跨接头引物序列如下:上游:

　　动物克隆技术所依靠的理论基础是细胞潜在全能性。所说的细胞的全能性是指细胞包含个体的全套遗传信息，在特定环境因素的调节下，可回到受精卵一样的状态，从头开始发育成一个完整的生物个体，只有具备全能性的动物组织细胞，才可用于克隆动物。对于体细胞克隆来说，在细胞分化过程中，细胞核全能性的潜能受到限制。虽然细胞核内的DNA序列没有改变，但基因在特定的细胞内所表达的蛋白质成分有限。这主要是因为染色体组织改变和稳定阻遏核蛋白复合体阻遏以及相应转录激活的缘故。因此有效的核移植供体核必须像正常受精卵细胞核一样进行细胞周期活动，才能发育成新个体，那么作为受体的细胞质就要求必须有再程序化供体核的能力。

　　4、陈永福,苟克勉,安晓荣.动物体细胞克隆技术及其应用前景.中国农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京100094.

　　如表1所示,共融合156枚重构胚,融合率为64.7%;激活后的144枚重构胚短暂培养后移入16只同步发情受体输卵管中,在移植后的30 d、60 d和90 d进行B超诊断,妊娠率分别为87.5%、81.3%和62.5%; 3只受体妊娠足月生下3只克隆羊,产羔率为18.8%,共4只受体在怀孕过程中流产,其中2只流产胎儿表现为肝肿大。

　　采用核移植的方法利用细胞拆合或细胞重组技术将卵母细胞去核作为核受体以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体将后者移入前者中构建重组胚供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程并启动卵裂开始胚胎发育过程妊娠产仔克隆出动物的技术又可称之为体细胞核移植技术

　　供体羊和受体羊均为波尔山羊与长江白山羊杂交羊。供体羊注射PG,于发情后第9~13天开始超排。连续3 d注射FSH,每天2次,总剂量260~300单位。第4天下午注射PG,第5天注射50单位LHRH。受体羊的同步除不注射FSH外均同供体羊。

　　无菌手术切取大约5 g左右的泌乳期(第5天)山羊乳腺实质组织,将腺泡组织剪成约1 mm3大小,用I型胶原酶消化液(含I型胶原酶200 IU/mL,透明质酸酶100 IU/mL)振荡消化1.5 h,收集悬液离心后,用D-hank’s离心洗涤3次,细胞计数并用培养液(含DMEM/F12, 10% FCS,乙酸钠5 mmol/L,转铁蛋白5 μg/mL,乙醇胺0.5 mmol/L,胰岛素10 μg/mL,氢化可的松5 μg/mL)调整密度至4×105个/mL接种于六孔板中,置CO2培养箱中, 37 oC、5% CO2、饱和湿度下静置培养。根据成纤维细胞对消化液敏感性不同,贴壁生长的细胞用0.05%胰蛋白酶 0.02%EDTA消化3 min后,弃去含脱壁成纤维细胞的消化液,重新加入培养液培养,传代重复3次可获得较纯的乳腺上皮细胞。

　　<转染、筛选

　　体细胞克隆技术是指把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态。采用核移植的方法，利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体，将后者移入前者中，构建重组胚，供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育过程，妊娠产仔，克隆出动物的技术。

　　纯化的山羊乳腺上皮细胞(图2)转染人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体,经G418抗性筛选14 d后,共挑取54个单克隆扩增传代,细胞诱导液经Western

　　blotting检测,其中有16孔的单克隆细胞表达的重组乳铁蛋白与人乳铁蛋白相似,分子量约为75 kD(图3),PCR检测结果证明均成功整合外源基因(图4)。