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　　体细胞克隆技术的研究进展 摘要 体细胞克隆绵羊“多莉”的诞生 ,表明成年哺乳动物体细胞具有基因组的全能性。论文从“多 莉”诞生的背景、体细胞克隆技术的研究现状、体细胞核移植过程中的核质互作、该技术目 前存在的问题及其在制作转基因动物上的应用等方面 ,概述了体细胞克隆技术的研究进展。 关键词 体细胞克隆 ;体细胞核移植 ;转基因动物 一、体细胞克隆技术 体细胞克隆技术是指把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态。采用核移植的方法， 利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细 胞核即核质体作为核供体，将后者移入前者中，构建重组胚，供体核在去核卵母细胞的胞质 中重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育过程，妊娠产仔，克隆出动物的技术，又可称之为 体细胞核移植技术。 早在 1950年，美国生物学家布格斯和金就开始了青蛙胚胎细胞的克隆研究。在1960年， 英国生物学家格登利成功的用青蛙体细胞克隆出蝌蚪。1993 年斯迪尔曼和赫尔报道在试管 婴儿研究中，获得可分裂的但不能在体外存活的人类胚胎细胞。1997年 2 月英国罗斯林研 究所的科学家成功的克隆了高等哺乳动物绵羊，诞生了克隆羊多莉。这一切在技术上为克隆 人类自身铺平了道路。 克隆绵羊的诞生证明一个完全分化成熟的体细胞，还能恢复到早期原始细胞状态,还能象胚 胎细胞一样保存全部遗传信息，推翻了生物学界有关用成年动物细胞无法培育成胚的理论， 是生物技术及其理论的革命。其次，克隆技术的发展，使科学家们拥有一件新的非常有效的 工具，来深入研究重要的生命科学问题，包括各种疾病的发病机理、生物生长发育的机制、 遗传和环境对生物的不同影响等等。再次，克隆技术将为动物遗传操作技术提供新途经，从 而培育出优良的家畜、家禽,并克隆出生长快、抗疾病的转基因动物，生产重要的药物，或 者为人类提供移植用的器官、组织和细胞。另外，克隆技术可以人为的保持人群中合理的性 比，可以保存珍贵的少数民族遗传组成，可以增加对生理性状有益的基因在群体中的频率， 可以为无精子患者产生自己的后代。 二、动物体细胞克隆技术的研究进展 动物克隆指不通过精子和卵子受精过程而获得与亲本具有相同遗传物质的后代的过程。动物 克隆包括孤雌生殖、卵裂球分离与培养、胚胎分割和细胞核移植等。 （一）突破性进展——克隆羊 目前,哺乳动物的克隆方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。过去人们认为,细胞的分化 程度越高 ,它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低 ,高度分化的高等成年动物体细胞甚 至完全不具备这种基因组全能性。但是 ,1997 年 2 月罗斯林研究所的伊恩 维尔穆特宣布 世界首例体细胞克隆绵羊“多莉”诞生这一突破性进展打破了这一观念。具体过程为:从芬 兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞 ,将其放入低浓度的营养培养液中 ,细胞逐渐停止了 分裂 ( 称之为供体细胞) ,再将其细胞核取出 ;从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受 精的卵细胞 ,并立即将其细胞核除去 ,留下一个无核的卵细胞 ( 称之为受体细胞) 利用电 脉冲的方法 ,使供体细胞核与去核卵细胞发生融合 ,融合细胞还可以产生类似于自然受精过 程中的一系列反应 ,能像受精卵一样进行细胞分裂、分化 ,从而形成胚胎细胞 ;将胚胎细胞 转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内 ,胚胎细胞进一步分化和发育 ,最后产出“多莉” 这只小。绵羊与多塞特母绵羊的外貌完全相同。因为它是世界上第一例经过体细胞核移植出 生的动物 ,是克隆技术领域研究的历史性突破 ,具有划时代意义。意味着在理论上证明了成 年哺乳动物的体细胞不仅具有基因组的全能性 ,而且还能在卵母细胞质中回复到发育的起 始状态 ,完成整个个体发生的过程 ;在实践上证明了利用体细胞进行动物克隆的技术是可行 的 ,将有无数相同的细胞作为供体进行核移植 ,并且在与卵细胞融合前可对这些供体细胞进 行一系列复杂的遗传操作 ,从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效 方法。令人兴奋的是它采用了一种全新的生殖方式, 即不经过精卵结合且其后代在基因型上 与其亲代完全等同, 它预示了一场涉及生殖、医学、生物制药等诸多领域的变革。同时一 伦理及宗教界人士也为此感到恐慌, 担心这项技术的应用会引起诸如乱伦等社会学问题。于 是各国纷纷出台禁止克隆人的政策, 但对于其它动物, 这项技术依旧方兴未艾。许多学者从 不同方面研究了影响体细胞克隆成功率的因素, 如核供体、核受体、供受体间的相互作用及 核移植操作过程等, 其目的在于提高体细胞克隆的成功率。 （二）克隆羊诞生后的体细胞核移植研究成果 a) 同种属内的体细胞核移植 1998 年 7 月 ,美国 T. Wakayama 等用小鼠卵丘细胞作核供体 ,克隆出小鼠 ,而后又 成功地用克隆出的小鼠卵丘细胞作核供体 ,从中克隆出第二代小鼠。他们克隆小鼠的技术相 对简单且成功率较高——“檀香山技—称术”。至 1999 年底 ,全世界已有 6 种类型细胞 ( 胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管/ 子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细 胞 ) 的体细胞克隆牛诞生。2000 年 6 月 16 日 ,我国张涌等从成年羊的耳朵取下皮肤细 胞培育出世界首例成年体细胞克隆山羊“元元”。 b) 不同种属间的体细胞核移植 1998 年 1 月 ,美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体 ,成功克隆出 猪牛羊鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎 ,表明某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成 熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了,但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999 年 ,美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎。1999 年 ,我国陈大元等将大熊猫的体 细胞植入去核的兔卵细胞中 ,培育出了大熊猫的早期胚胎。2001 年 ,Loi 等将欧洲盘羊的颗 粒细胞移植到去核的绵羊卵母细胞中也克隆出欧洲盘羊。这些成果说明克隆技术有可能成为 保护和拯救濒危动物的一条新途径。 c) 体细胞核移植与转基因动物 用体细胞核移植法制作转基因动物效率高。这是因为用作核供体的细胞的确是整合了某一外 源结构基因的细胞 ,一旦核移植成功 ,就意味着得到了转基因动物。1999 年 ,美国科学家首 次利用体细胞克隆技术生产出了人类历史上第一头转基因克隆牛 ,2002 年新西兰与澳大利 亚科学家合作也获得了转基因体细胞克隆牛。2003 年 , 李宁等培育了 10 头体细胞克隆牛。 其中包括两头转基因体细胞克隆牛“乐娃”岩娃”“乐娃”:“、。转入了绿色荧光蛋白基因, 标志着我国在转基因体细胞克隆的新突破。“岩娃”创造了两个世界首次:首次获得了转有 人岩藻糖转移酶基因的转基因体细胞克隆牛 ;首次获得了在同一头牛中转有 3 种外源基因 ( 绿色荧光蛋白基因、人岩藻糖转移酶基因和新霉素抗性基因) 的转基因体细胞克隆牛。这 标志着我国转基因体细胞克隆牛的生产技术体系已经成熟。 （三）目前体细胞核移植技术存在的问题 a) 克隆效率及存活率低 比正常的要短 ,说明其细胞处于更衰老的状态。当时认为是因用成年绵羊的细胞作供体造成 的 ,使其细胞带有成年细胞的印记 ,但美国罗伯特 兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛 ,得到 的小牛的端粒比普通同龄牛长 ,有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。因此 , 染色体端粒变 短是否与提供供体核的动物的年龄有待研究。此外基因组重新编程的机制尚不清楚。克隆不 同种属的动物为难易有别,其中的原因不清楚。目前可用作体细胞核移植核供体的细胞类型 还较少。 b) 动物克隆技术的条件尚需优化 克隆效率一般仅为 1 %～ 6 %而且存活率低。表现为孕期流产率高 , 围产期死亡率高 ,新生 儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。 c) 部分个体表现出生理或免疫缺陷 例如克隆牛 ,大部分已死去。解剖表明 , 因部分犊牛胎盘功能不完善 ,其血液中含氧量及生 长因子的浓度都低于正常水平。有些克隆牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正 常发育。 d) 基础理论研究有待加强 1998 年 ,Shiel s 等发现“多莉”的染色体端粒。核供体和卵细胞的选材、核质比的选 择、重组胚胎的激活方式、是否需要作连续核移植等均需进一步研究。 三、植物体细胞克隆技术 在许多人眼里 ,体细胞克隆羊的诞生是克隆技术的开始。事实并非如此。在植物界 ,克隆的 应用已有上千年的历史 ,理论上的突破则是 20

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