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　　背景——成人起病的炎症综合征通常表现出重叠的临床特征。泛素相关基因的变异此前与自身炎症性疾病相关，可能定义新的疾病。

　　方法——我们分析了与临床表型和遗传模式无关的外周血外显子组序列数据，以识别泛素相关基因中的有害突变。我们还进行了桑格测序、免疫印迹、免疫组织化学检测、流式细胞术以及转录组和细胞因子谱分析。利用CRISPR-Cas9编辑的斑马鱼作为体内模型来评估基因功能。

　　结果——我们发现25名男性存在影响UBA1中蛋氨酸-41（41）的体细胞突变，UBA1是启动泛素化的主要E1酶（UBA1基因位于X染色体上）。这类患者在成年晚期会出现一种往往致命且对治疗有抵抗性的炎症综合征，症状包括发热、血细胞减少、髓系和红系前体细胞中出现特征性空泡、骨髓增生异常、中性粒细胞性皮肤和肺部炎症、软骨炎以及血管炎。这25名患者中，大多数符合某种炎症综合征（复发性多软骨炎、Sweet综合征、结节性多动脉炎或巨细胞动脉炎）或血液系统疾病（骨髓增生异常综合征或多发性骨髓瘤）的临床标准，或同时符合两者。在超过半数的造血干细胞中发现了突变，包括外周血髓系细胞，但淋巴细胞或成纤维细胞中未发现。影响p.Met41的突变导致UBA1的经典细胞质亚型缺失，并表达一种新的、催化功能受损的亚型，该亚型始于p.Met67。突变的外周血细胞显示泛素化减少，且先天免疫通路被激活。敲除斑马鱼中细胞质UBA1亚型的同源物会引发全身性炎症。

　　结论——通过基因型驱动的方法，我们发现了一种可将看似不相关的成人起病炎症综合征联系起来的疾病。我们将这种疾病命名为VEXAS（空泡、E1酶、X连锁、自身炎症、体细胞）综合征。（由美国国立卫生研究院院内研究项目和欧盟“地平线”研究与创新计划资助。）

　　确定全身性炎症性疾病的病因，尤其是在成年人群体中，仍然是一项挑战，这限制了我们对病理生理学、预后以及治疗。遗传学方法为孟德尔式自身免疫性疾病1以及自身炎症性疾病2,3和遗传复杂性疾病的发病机制提供了重要见解。4 长期以来，获得性并经克隆选择的体细胞突变一直与良性和肿瘤性血液疾病有关5，但在自身炎症性疾病和风湿性疾病中的作用仍知之甚少；这些突变主要是通过靶向测序方法发现的。

　　基因组DNA测序的广泛应用催生了以基因型为导向的人类疾病研究方法。7-9 这种方法的起点通常是召集一组接受过基因组测序、且表型不一定相似的人。其目标是在一个共同基因中找到有害变异，这些变异是先前未被识别的、具有特定临床特征的患者群体的病因。这些研究利用共同的遗传特性而非临床相似性，来克服识别离散表型的局限性。风湿病可能非常适合这种方法，因为它们的临床表现复杂且变异性强。

　　在当前研究中，我们采用基因型驱动的方法来确定炎症性疾病的遗传病因。由此，我们在患有迟发性、难治性炎症综合征并伴有血液学异常的男性患者中，发现了UBA1基因中反复出现的失活获得性突变，该基因编码泛素激活酶1。UBA1是泛素化起始所必需的，泛素化是一种蛋白质的翻译后修饰方式，用于调节细胞生物学的多个方面，包括细胞内信号传导以及通过蛋白酶体或自噬-溶酶体系统进行的蛋白质降解。我们将这种疾病命名为VEXAS（液泡、E1酶、X连锁、自身炎症、体细胞）综合征。

　　通过对美国国立卫生研究院（NIH）临床中心基因数据库中的外显子组数据进行分析，确定了3名受影响男性，每人都携带一个体细胞UBA1变体。在NIH临床中心的观察队列中，又发现了15名男性，他们与之前的3名受影响男性具有临床相似性，其体细胞UBA1变体通过桑格测序得到了证实。另外7名参与者是在英国伦敦大学学院和利兹教学医院NHS信托基金会的研究人群中确定的。所有参与者均纳入了经各自机构审查委员会批准的研究，并提供了书面知情同意书。临床诊断是根据标准标准确定的。10-16

　　我们对首批3名参与者和另外3名参与者的外显子组进行了测序，并对其他19名参与者及其未受影响的家庭成员的UBA1基因进行了测序。由于泛素化的翻译后过程具有重要意义，我们优先关注了参与该过程的基因。对先天免疫反应的调节。17 我们使用数字液滴聚合酶链反应测定法、免疫印迹法、免疫组织化学检测、电子显微镜、流式细胞术和细胞因子谱分析，对从参与者那里获得的血液和成纤维细胞样本中的分馏细胞类型进行了分析。为了研究假定的病因变体对UBA1功能的影响，我们使用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）-Cas9（CRISPR相关蛋白9）系统编辑了斑马鱼的基因组。本文的补充附录（可在阅全文）包含了这些程序所用方法的描述。

　　连续变量以均值±标准差或中位数（四分位距）表示，并根据情况采用参数检验或非参数检验进行比较。分类变量以绝对数和百分比表示，采用卡方检验进行比较。转录组学分析的统计方法详见补充附录。对于多组比较的实验，采用事后Bonferroni校正，结果以校正后的P值表示。

　　我们对1477名因不明原因复发性发热、全身性炎症或两者皆有而转诊的人员，以及通过未确诊疾病项目确定的1083名患有非典型、未分类疾病的人员进行了外显子组和基因组筛查。18 参与者群体在性别方面大致均衡，且年龄跨度较大（图1A）。我们发现3名男性，他们在X连锁基因UBA1的同一位点（甲硫氨酸-41，p.Met41）均存在新的（在包括基因组聚合数据库在内的公共数据库中未出现）、预测为有害的、且明显为杂合的变异，该基因对单倍体不足具有高度不耐受性（“功能缺失不耐受概率”[pLI]得分为1.0，分值范围为0.0至1.0，分值越高表明健康人群对功能缺失变异的不耐受程度越高）。这3名受影响男性中出现的看似杂合的变异引发了关于镶嵌现象或非整倍体的疑问，因为男性通常只有一个X染色体基因拷贝。考虑到体细胞突变在成人发病型疾病中可能发挥的作用，我们对所有变异进行了评估，包括那些等位基因频率低于预期的变异。

　　我们通过桑格测序确认了所有相关的UBA1变体（补充附录中的图1A和图S1），并确定这些变体在受测参与者的成纤维细胞中不存在（图S2）。25名受影响男性均无受影响的家庭成员，且8名可检测的亲属均为该突变阴性。通过高密度单核苷酸多态性阵列分析确定，参与者的核型分析未显示非整倍体，也不存在X染色体拷贝数变异（图S2C）。因此，我们推测这些明显的杂合变体是体细胞（也称为嵌合或合子后）突变，其中遗传异质性细胞携带半合子野生型或突变的UBA1。20

　　为了证实这些发现，我们对主要来自141,600人的全血样本的外显子组数据进行了分析，这些人（77,162名未受影响的成年人和64,438名接受过诊断检测的人，其中大多数患有神经发育疾病）均在一家诊断公司（GeneDx）接受过测序。所有未受影响的人都没有UBA1 p.Met41等位基因比例超过5%的情况。至于受影响的人，只有5%（其中大多数是儿童）表现出免疫表型。然而，我们发现3名男性的UBA1 p.Met41变异等位基因频率超过71%（表S1），他们都患有迟发性炎症性疾病。因此，这两项筛查均仅在患有成人起病的炎症性疾病的男性中发现了UBA1 p.Met41体细胞突变。

　　为了表征嵌合体，我们分离并测序了不同的造血细胞群。携带UBA1嵌合突变的参与者外周血中，淋巴细胞（T细胞和B细胞）以野生型为主，髓系细胞（中性粒细胞和单核细胞）以突变型为主（图1B和1C）。尽管UBA1突变在血液中具有谱系限制性，但早期骨髓祖细胞仍存在嵌合现象。从骨髓中分离出的造血干细胞、多能祖细胞、粒-单核细胞祖细胞、巨核细胞-红细胞祖细胞以及淋巴样祖细胞中都含有大量突变细胞，而成熟淋巴细胞中则没有突变。参与者的外周血淋巴细胞计数减少，这表明突变细胞要么没有增殖，要么被清除，这一结果导致野生型基因型的比例增加（图S3）。

　　前3名参与者均为男性，他们在50至70岁期间出现了严重的炎症综合征。常见的临床特征包括肺泡炎、耳鼻软骨炎、皮肤病变和血栓栓塞性疾病（图2）。每位参与者都有进行性血液学异常，包括大细胞性贫血、血小板减少症和髓系发育异常，但均无明显的血液系统恶性疾病。这3名参与者共有的唯一遗传损伤是UBA1基因p.Met41位点的非同义错义突变（图S4）。我们又确定了22名具有重叠临床表型的参与者，其中7名来自现有的复发性多软骨炎患者队列（ClinicalTrials.gov编号，NCT02257866）（表1；另见补充附录）。在18名根据临床特征（成年起病的炎症综合征和血细胞减少的男性，以及软骨炎、血管炎、中性粒细胞性皮肤病或上述疾病的组合）接受基因筛查的参与者中，有14名（78%）被发现存在UBA1基因突变。

　　25名经确认存在UBA1基因突变的参与者接受了全面的临床评估（表S2至S8）。所有参与者均为男性，发病中位年龄为64岁。这些参与者每人都携带UBA1基因第41密码子的三种体细胞变异之一（预测会导致氨基酸替换p.Met41Val [NM_003334.3:c.121A￫G；ClinVar登录号SCV001438043]、p.Met41Thr[NM_003334.3:c.122T￫C；ClinVar登录号SCV001438045]或p.Met41Leu[NM_003334.3:c.121A￫C；ClinVar登录号SCV001438044]）。这些参与者大多有反复发热、肺部受累、皮肤表现（包括中性粒细胞性皮肤病和皮肤血管炎）、大细胞性贫血、造血发育异常，以及仅限于髓系和红系前体细胞的骨髓空泡形成（表1、图2、表S3以及图S5和图S6）。电子显微镜显示，髓系细胞正在发生细胞死亡，并有包含脂滴和紊乱细胞器（包括退化线粒体）的空泡。

　　部分参与者亚组达到或部分达到了多种临床疾病既定的诊断或分类标准（表1和表S2）。所有参与者均未转化为伴有原始细胞增多的骨髓增生异常综合征或急性髓系白血病。所有25名参与者的急性期反应物水平均显著升高，且对多种改善病情的抗风湿药物无反应（表S4和表S5）。糖皮质激素（常以高剂量给药）是唯一能持续缓解严重炎症症状的治疗方法。在25名参与者中，有10名（40%）死于疾病相关原因（呼吸衰竭或进行性贫血）或与治疗相关的并发症。

　　对参与者外周血的转录组分析显示，存在一个共同的基因表达特征，这与多种先天性免疫通路的激活相符（图S7A、S7B及表S9）。对分离出的单核细胞和中性粒细胞进行的基因表达谱分析（这些细胞是在参与者接受最少治疗的临床静止期研究的）显示，在多个通路中存在高度激活的炎症特征，包括肿瘤坏死因子、白细胞介素-6和干扰素-γ通路，这一发现与细胞内在的严重髓系炎症相符（图S7C及表S10至S12）。仅在髓系细胞中发现了影响未折叠蛋白反应和整合应激反应的通路被激活（图S8）。21血清中多种细胞因子水平升高，与转录组分析的结果一致（图3）。外周B细胞和单核细胞表现出非典型分化，未成熟B细胞以及非经典和中间单核细胞群减少（图S9）。对VEXAS综合征参与者与年龄和性别匹配的健康对照者的中性粒细胞进行的功能研究显示，突变细胞的吞噬能力保持正常，但自发性中性粒细胞胞外陷阱形成增强，这些发现与促炎性中性粒细胞激活失调相符（图S10）。

　　UBA1编码所有细胞泛素信号启动所需的主要E1激活酶。22-25 UBA1以两种异构体形式表达，其差异在于翻译起始位点——核UBA1a（起始于p.Met1）和细胞质UBA1b（起始于p.Met41）（图4A）。出乎意料的是，与对照组相比，从VEXAS综合征患者获取的单核细胞以及异位表达的UBA1 Met41Val与野生型酶相比，尽管UBA1b的起始甲硫氨酸缺失，但其核定位和细胞质定位相似（图S11A至S11C）。

　　接下来，我们通过免疫印迹法分析了人胚肾（HEK293T）细胞中UBA1 Met41变体的表达，结果显示UBA1b缺失，且出现了一条出乎意料的迁移速度更快的条带（图4B和图S11B）。我们推测，产生这条迁移速度更快条带的蛋白质可能是从下游起始密码子开始翻译起始产生的同工型（图4A）。实际上，针对Met67密码子引入突变后，这条迁移速度更快的条带消失了，这表明这种新的UBA1同工型（此处命名为UBA1c）的信使RNA转录是从Met67密码子开始的。UBA1c定位于细胞质（图S11A），这一发现与我们对VEXAS综合征患者单核细胞的观察结果一致。在硫酯测定中，与纯化的重组UBA1a和UBA1b相比，纯化的重组UBA1c的催化功能受损，这一点可从以下现象看出：UBA1c泳道中主要是迁移速度更快的未带电形式，而其他受测UBA1蛋白则以带电形式为主（图4C）。因此，我们得出结论，Met41变体通过促进催化缺陷型UBA1c的产生、而非催化有效型UBA1b的产生，导致细胞质中UBA1的功能降低。

　　随后，我们尝试通过研究参与者细胞中这种同工型转换的后果来证实这种细胞质同工型转换。参与者（其中绝大多数为野生型）和未受影响的对照者的纯化T细胞中，UBA1a和UBA1b蛋白的含量相当（图4D）。相比之下，参与者中主要携带突变型UBA1变体的单核细胞，其UBA1b水平降低，且可检测到UBA1c，这证实了转染研究的结果（图4D）。突变单核细胞的泛素化存在缺陷，表现为多聚泛素种类减少，同时游离泛素增加（图4D）。这些细胞还显示出eIF2α磷酸化增加和LC3水平改变，这表明泛素化的缺失会激活细胞应激反应，进而导致未折叠蛋白反应上调（如eIF2α磷酸化增加所示）和自噬失调（如LC3水平改变所示）（图4D）。

　　为了研究体内核和细胞质UBA1亚型对炎症性疾病的作用，我们建立了CRISPR-Cas9编辑的斑马鱼模型（表S13）。斑马鱼uba1与人类UBA1高度同源（图S12）。由于uba1对生存能力至关重要，26-28我们评估了其在早期发育过程中的炎症情况。在转基因Tg（mpx:EGFP [mpx启动子控制增强型绿色荧光蛋白的表达]）斑马鱼中，Uba1所有亚型的纯合缺失（Δuba1 [Δ表示蛋白质缺失]）或仅Uba1b的缺失（Δuba1b），而非Uba1a的缺失（Δuba1a），导致中性粒细胞数量低于同窝对照杂合子或野生型鱼（图S13）。所有三种uba1缺陷的斑马鱼品系在受精后7至21天内均表现出生长异常和早逝，这一发现可能部分归因于这些突变的种系性质，而VEXAS综合征患者中发现的是体细胞变异。最后，与所观察到的情况相似，Δuba1或Δuba1b（而非Δuba1a）导致斑马鱼中炎症基因的表达上调。参与者（图4E）。综上所述，这些结果支持了这样一种观点，即全身性炎症是由细胞质UBA1及其斑马鱼同源物的破坏引起的。

　　以基因型为先、表型中立的人类疾病研究策略取得了积极成果——确定了一种成人起病的严重炎症性疾病的病因。我们发现，髓系谱系限制性UBA1体细胞突变是具有重叠血液学特征、临床表现复杂且看似不同的多种疾病诊断的共同病因。

　　泛素化是一个三步过程，由泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和底物特异性连接酶（E3）协同作用完成。其中，泛素激活酶包含2种独特的酶；泛素结合酶包含约40种独特的酶；泛素连接酶则包含600多种独特的酶。泛素信号的生理调节通常发生在E2和E3酶水平，但人们对泛素激活的调控知之甚少。我们的研究发现，VEXAS综合征的一个主要病因是细胞质中UBA1的耗竭，这支持了在造血过程中，亚细胞水平调控的泛素激活具有关键作用。

　　UBA1几乎是所有细胞泛素信号传导所必需的，在模式生物和培养细胞中也不可或缺。仅在体细胞中发现UBA1变体这一情况，可能反映出这样一个事实：影响p.Met41的突变若为种系突变则具有致死性，而只有当该突变在特定细胞类型中呈嵌合状态时，才与生命存活相兼容。32,33我们观察到，VEXAS综合征患者的炎症是由突变的髓系细胞引发的，且这些突变髓系细胞的数量超过了野生型髓系细胞。这些发现表明，髓系前体细胞携带这种体细胞突变仍可存活，而突变的淋巴细胞在骨髓内会被负向选择，这与淋巴细胞相较于髓系细胞在未折叠蛋白反应和蛋白毒性应激方面具有选择性毒性的观察结果一致。34我们仅在男性中发现了这种突变，且所有这些男性均表现出临床症状，这一事实表明，女性体内的另一个等位基因可抵御突变等位基因的影响，不过，由于X染色体失活偏倚，女性的病情可能更轻。更广泛地说，我们的研究结果表明，X连锁嵌合突变可能会引发其他疾病。

　　长期以来，人们已知造血干细胞的体细胞突变与髓系癌症、骨髓衰竭综合征以及阵发性睡眠性血红蛋白尿等良性血液疾病相关，且最近发现其还是一种常见的、与年龄相关的过程，被称为意义未明的克隆性造血。35,36 体细胞突变还与纯红细胞再生障碍性贫血中T细胞介导的调节异常37,38以及大颗粒淋巴细胞增多症存在因果关联。39 UBA1基因中髓系限制性的体细胞突变可能是骨髓增生异常疾病的基础，并伴有全身性炎症。例如，患有复发性多软骨炎的老年男性会出现骨髓增生异常综合征范围内的血液异常，死亡风险增加。40 复发性多软骨炎与骨髓增生异常的共存可能由VEXAS综合征解释。同样，伴随的骨髓增生异常也已在本研究中，每种与VEXAS综合征相关的风湿病（包括结节性多动脉炎、Sweet综合征和巨细胞动脉炎）中均有相关报道。鉴于VEXAS综合征患者的死亡率较高，应考虑努力寻找针对克隆性体细胞过程的有效治疗策略，例如骨髓移植或基因编辑疗法。

　　通过基因型驱动的方法，我们发现了一种能够将看似不相关的成人起病型炎症综合征联系起来的疾病。我们将这种遗传性疾病命名为VEXAS综合征，它是由UBA1基因中髓系限制性体细胞错义突变引起的。我们的研究结果表明，体细胞突变可导致在成年期表现出来的严重炎症性疾病。

　　苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。

　　木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。

　　木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。

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