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　　体细胞克隆技术的原理及过程 体细胞克隆技术的原理及过程 胡钟星 （生物工程四班 内容提要：体细胞克隆技术是指把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态。采用核移植的方法，利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体，将后者移入前者中，构建重组胚，供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育过程，妊娠产仔，克隆出动物的技术，又可称之为体细胞核移植技术。比如克隆绵羊“多利”，它是利用细胞拆和技术将成熟母绵羊乳腺细胞核取出并导入到另一只母绵羊的去核卵细胞，再将这个基因已被“调包”的卵细胞放电激活，使其开始像正常的受精卵那样进行细胞分裂；当细胞分裂进行一定连阶段、胚胎已经形成后，再将这个胚胎植到第三只母绵羊，经过正常的妊娠后产下“多利”。 关键词：体细胞克隆、核移植技术、克隆原理、乳腺上皮细胞、山羊 正文： 一、概述： 克隆是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。动物克隆方法主要有两种，一是胚胎分割；二是细胞核移植。胚胎分割技术克隆胚胎一次只能得到1-4个克隆，因此潜力有限。细胞核移植技术是动物克隆的主要手段，通常所说动物克隆技术是指动物细胞核移植克隆动物的技术。用于核移植的动物细胞又分两种，一是来自早期胚胎，即胚胎细胞；二是来自成体动物的各种组织，即体细胞。 体细胞克隆技术是指把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态。采用核移植的方法，利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体，将后者移入前者中，构建重组胚，Kaiyun网站供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育过程，妊娠产仔，克隆出动物的技术。 二、原理： 动物克隆技术所依靠的理论基础是细胞潜在全能性。所说的细胞的全能性是指细胞包含个体的全套遗传信息，在特定环境因素的调节下，可回到受精卵一样的状态，从头开始发育成一个完整的生物个体，只有具备全能性的动物组织细胞，才可用于克隆动物。对于体细胞克隆来说，在细胞分化过程中，细胞核全能性的潜能受到限制。虽然细胞核内的DNA序列没有改变，但基因在特定的细胞内所表达的蛋白质成分有限。这主要是因为染色体组织改变和稳定阻遏核蛋白复合体阻遏以及相应转录激活的缘故。因此有效的核移植供体核必须像正常受精卵细胞核一样进行细胞周期活动，才能发育成新个体，那么作为受体的细胞质就要求必须有再程序化供体核的能力。 三、过程： 动物克隆技术主要包含以下几个步骤： 动物克隆技术的核心是核移植。 核供体动物的选择与细胞核的获得。 核受体动物的选择与细胞核的移出。 供体核的移入及原核的取出。 胚泡的体外试管培养。 代母的选择与胚泡移入子宫。 克隆动物的体内发育与出生。 下面以转染乳腺上皮细胞为供核细胞制备克隆羊为例描述克隆动物的产生。 1 材料与方法 1.1 化学试剂与实验材料 DMEM/F12 购自Gibco 公司; FCS 购自Hyclone公司; 电转染液(Hypoosmolar Buffer)购自eppendorf 公司; FSH, LHRH和PG 购自宁波激素厂; 其他试剂除特殊说明外, 均购自Sigma 公司; 实验羊购自徐州地区。 1.2 hLF 表达载体转染乳腺上皮细胞 1.2.1 乳腺上皮细胞的培养 无菌手术切取大约5 g 左右的泌乳期(第5 天)山羊乳腺实质组织, 将腺泡组织剪成约1 mm3 大小,用I 型胶原酶消化液(含I 型胶原酶200 IU/mL, 透明质酸酶100 IU/mL)振荡消化1.5 h, 收集悬液离心后, 用D-hank’s 离心洗涤3 次, 细胞计数并用培养液(含DMEM/F12, 10% FCS, 乙酸钠5 mmol/L, 转铁蛋白5 μg/mL, 乙醇胺0.5 mmol/L, 胰岛素10 μg/mL, 氢化可的松5 μg/mL)调整密度至4×105 个/mL 接种于六孔板中, 置CO2 培养箱中, 37 oC、5% CO2、饱和湿度下静置培养。根据成纤维细胞对消化液敏感性不同, 贴壁生长的细胞用0.05% 胰蛋白酶 + 0.02%EDTA 消化3 min 后, 弃去含脱壁成纤维细胞的消化液, 重新加入培养液培养, 传代重复3 次可获得较纯的乳腺上皮细胞。 1.2.2 细胞转染、筛选 用Sal I 和Not I 双酶切pBLC-14 质粒(本室保存)获得线性化hLF 乳腺特异性表达载体(图1), 经QIAEX 试剂盒回收后溶于超纯水中, ?20 oC 保存。收集对数期乳腺上皮细胞, 用电转染液洗涤离心后重悬细胞密度至1×106 个/mL, 加入DNA 使终浓度为10 μg/mL, 以2.0 kV/cm、100 μs 的条件电击1 次, 48 h后加入400 μg/mL G418 筛选, 每2 天换1 次液, 14 d后挑取克隆细胞以200 μg/mL G418 筛选扩增传代, 用DMEM/F12 + 10% DMSO + 20% FBS 的冷冻液冻存。 1.2.3 细胞整合和表达产物的检测 在冷冻细胞同时, 每孔留一半扩增至80%的丰度后, 在培养液中加入催乳素(5 μmol/L)诱导人乳铁蛋白的表达, 48 h 后收集培养液进行SDS电 泳和Western blotting 检测。收集经过诱导的细胞, 提取DNA 进行PCR检测, 跨接头引物序列如下: 上游: 5′-ATGGGCGTGGATAGCGGTTTGAC-3′; 下游: 5′-CCACCA TCAAGGGTCACAG CATCG-3′。阳性细胞孔作供核细胞。 1.3 供体羊与受体羊的准备 供体羊和受体羊均为波尔山羊与长江白山羊杂交羊。供体羊注射PG, 于发情后第9~13 天开始超排。连续3 d 注射FSH, 每天2 次, 总剂量260~300单位。第4 天下午注射PG, 第5 天注射50 单位LHRH。受体羊的同步除不注射FSH 外均同供体羊。 1.4 供核细胞与卵母细胞的准备 冷冻乳腺上皮细胞解冻后培养至80%汇合后,在0.5% FCS 培养液中饥饿48 h, 于核移植前2 h 胰蛋白酶消化处理, 用M2 悬浮细胞备用。卵母细胞在注射LHRH 后26~30 h 输卵管手术冲取, 用透明质酸酶消化并吹打去除颗粒细胞。 1.5 核移植、融合和激活 卵母细胞预先置于含5 μg/mL Hoechst33342 和7.5 μg/mL CB 的M2 中处理20 min, 在荧光下确定纺垂体位置并去核, 同时吸取中等大小光滑的乳腺上皮细胞, 移入卵周隙中。一批结束后, 重构胚移入M16中培养30~60 min 后开始融合(融合液: 0.3 mmol/L 甘露醇、0.05 mmol/L 氯化钙、0.1 mmol/L 硫酸镁、3%BSA), 条件为2.1 kV/cm、40 μs、2 个脉冲。融合后在M16 中培养30~60 min 后观察, 未融合卵按以上条件重复1 次。融合卵在M16 中培养5 h; 在激活液(5 μmol/L 离子霉素 + 7.5 mg/mL CB)中5 min; 然后在含有2 mmol/L 6-DMAP和7.5 μg/mL CB的M16中培养5 h, 然后移入M16 中短暂培养直到胚胎移植。 1.6 胚胎移植 激活后培养的胚胎手术法移入同步发情受体的输卵管内, 每只受体移植4~15 枚胚胎, 在胚胎移植后30 d、60 d 和90 d 进行B 超诊断妊娠情况。 1.7 克隆羊鉴定 克隆羊鉴定采用 PCR+RFLP(限制酶片段多态性分析)的方法[11]。扩增山羊MHCⅡ类DRB 基因第二外显子的引物为: 1)DRB1.1: 5′-ATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3′;2)Gio:5′-CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3′; 3)DRB1.2: 5′-TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3′。常规方法提取克隆羊、寄母羊和供核细胞羊基因组DNA。以样品DNA 为模板进行PCR 扩增, 第1 轮以1)、 2)为引物, 进行10 个循环; 用扩增产物为模板再加入1)、3)引物进行第2 轮扩增, 30 个循环。PCR 产物经Rsa I 酶切、10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 染色拍照观察结果。 2 结果 2.1 乳腺上皮细胞表达hLF 和整合检测 纯化的山羊乳腺上皮细胞(图2)转染人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体, 经G418 抗性筛选14 d 后,共挑取54 个单克隆扩增传代, 细胞诱导液经Western blotting 检测, 其中有16 孔的单克隆细胞表达的重组乳铁蛋白与人乳铁蛋白相似, 分子量约为75 kD(图3),PCR 检测结果证明均成功整合外源基因(图4)。 2.2 克隆胚的发育情况 如表1 所示, 共融合156 枚重构胚, 融合率为64.7%; 激活后的144 枚重构胚短暂培养后移入16只同步发情受体输卵管中, 在移植后的30 d、60 d和 90 d 进行B 超诊断, 妊娠率分别为87.5%、81.3%和62.5%; 3 只受体妊娠足月生下3 只克隆羊,产羔率为18.8%, 共4 只受体在怀孕过程中流产, 其中2 只流产胎儿表现为肝肿大。 2.3 克隆羊鉴定 出生的3 只克隆羊表型为黑白花色, 与供核羊表型一致。分别提取克隆羊、寄母羊和供核羊基因组DNA, 采用PCR+RFLP 的方法分析表明, 克隆羊条带与供核羊一致, 而与寄母羊不同, 从而证明克隆羊来自于供核羊细胞(图5、图6)。 3 讨论 目前已有多种类型的体细胞用来生产克隆动物。但是, 用乳腺上皮细胞为供核细胞生克隆羊研究的报道较少, 至今还没有出生克隆山羊的相关报道。并且 , 乳腺上皮细胞作为转基因小鼠的替代品, 可用来评估目的基因在转基因克隆动物中的表达效率, 若结合其他适当的筛选方式, 以诱导表达目的蛋白的转基因乳腺上皮细胞为供核细胞, 能提高生产转基因动物的效率和降低成本。本实验以表达人乳铁蛋白的转基因乳腺上皮细胞系进行核移植, 共生产了3 只克隆羊, 从而在国内外首次证明山羊乳腺上皮细胞经过转染和长期筛选的条件下,能保持发育的全

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