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　　经过5年科研攻关，中国科学家培育出世界上首只高比例胚胎干细胞“嵌合猴”。

　　这只“嵌合猴”由食蟹猴（长尾猕猴）的两个基因不同的胚胎的细胞培育而来。11月10日，这项由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）研究员刘真、孙强和中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员Miguel A. Esteban研究组合作完成的研究，以封面论文形式在线发表于《细胞》。

　　“这是该领域长期追求的一个目标。它毫无疑问是迄今除了啮齿类动物之外，利用多能干细胞产生嵌合体动物的最佳实证。”该论文多位审稿人如是评价。

　　中国科学院院士季维智评价该研究是灵长类多能干细胞多能性研究的一个重要突破，为干细胞多能性研究提供了一个重要平台，也为后续利用干细胞建立疾病猴模型，通过四倍体补偿法产生干细胞猴以及体内构建组织器官打下了重要的基础。

　　胚胎干细胞是生命发育早期的“种子”细胞，具有无限自我复制更新的能力和极强的诱导分化发育潜能。这使得它们在细胞治疗、器官再生、类器官模型构建等方面发挥着重要作用。

　　如何证明胚胎干细胞具有多向分化潜能呢？一个“金标准”是将取自一个囊胚的干细胞注射到发育中的另一个囊胚内，形成拥有不同基因型的嵌合体。

　　“理论上，注射的胚胎干细胞具有很强的体内发育潜能，可以为嵌合体不同器官的发育作出很大的贡献。”论文通讯作者刘真在接受《中国科学报》采访时说。

　　胚胎干细胞的发育多能性已在啮齿类动物中得到了证明。科学家在1984年首次实现小鼠胚胎干细胞胚胎注射形成嵌合体，于2008年成功实现大鼠胚胎干细胞胚胎注射形成嵌合体。构建非人灵长类胚胎干细胞嵌合体技术对生物医药研究具有重要意义，然而相关研究一直进展缓慢。

　　制造嵌合体，要先把干细胞从囊胚内取出放在体外培养，再把体外扩增培养的胚胎干细胞重新放回囊胚生长发育。“一出一进”之间有两大难关。

　　第一大难关是如何获得具有高效发育潜能的胚胎干细胞。为突破难关，刘线天的食蟹猴囊胚分离干细胞，这个时期的囊胚已经分裂出约100个细胞，每个细胞都具有非常强的分化发育潜能，但尚未开始出现方向性的分化。研究人员将分离的干细胞放在体外培养，让其保留分裂复制特征，但不再向下分化。

　　他们最后建立了食蟹猴的9个干细胞系，并将其放置在6种不同的培养体系下对其“健康”进行把关。通过单细胞转录组、线粒体代谢、全基因组测序等多方面系统评估，研究人员确定了具有更高多能性、更好传代稳定性和基因组稳定性的多个干细胞系。

　　第二大难关是胚胎干细胞注射到受体胚胎后的快速凋亡。为此，研究团队给选出的胚胎干细胞标记绿色荧光蛋白，以追踪干细胞存活情况。经过反复实验、试错，他们终于找到了既不影响胚胎正常发育，又能保证干细胞存活的最优嵌合胚胎培养条件。

　　2021年初，闯过上述难关的刘真与合作者把选好的干细胞注射到早期的猴子桑葚期胚胎（发育4~5天的胚胎）中，并将74个具有明显嵌合的囊胚移植到40只受体雌猴体内，最后获得了4只流产的胚胎和6只出生的猴子。

　　这些流产的胚胎或活产的猴子是否都是嵌合体呢？研究人员检测发现，只有1只流产的胚胎和1只活产的猴子产生了明显的嵌合。

　　“所以，做出嵌合体的成功率约40%，做出活产嵌合体的成功率约20%。”论文共同通讯作者孙强对《中国科学报》说。

　　这个“不算太糟”的结果就是世界上首只高比例胚胎干细胞嵌合猴，研究人员花费了近3年时间才让它成功降世。

　　由于非人灵长类嵌合体培养存在巨大挑战，2012年，美国科学家在发表于《细胞》的一项研究中曾认为，猴胚胎干细胞不能产生嵌合体，挑战了灵长类胚胎干细胞多能性理论基础。

　　不过，科学家并未放弃尝试。昆明理工大学的科学家随后证明猴多能干细胞，包括始发态的多能干细胞，能够产生嵌合体，但嵌合率仅为0.1%~4.5%。“这表明当时所获得的多能干细胞与囊胚期的内细胞团或外胚层，仍存在较大差异。”昆明理工大学省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室教授李天晴说。

　　此次，研究人员使用绿色荧光蛋白标签、基因测序以及其他测试方法，确认了活产猴大脑、心脏、肾脏、肝脏和胃肠道中都含有干细胞来源细胞的组织类型。在不同组织类型中的贡献从21%到92%不等，在测试的26种不同组织类型中平均为67%。相比之下，那只流产嵌合体猴的平均贡献比例约为20%。

　　“这些数据有力地证明了猴子多能干细胞具有在体内分化成各种组织的能力。”论文共同通讯作者Miguel A. Esteban对《中国科学报》说，“这项研究加深了对灵长类动物多能干细胞发育潜力的理解。”

　　研究人员将取自雌性猴子胚囊的干细胞放入雄性胚胎后，发现尽管最终形成的存活嵌合体是雄性，但其血液细胞、皮肤细胞中检测出部分雌性基因。

　　“这很有趣。”孙强说，“它证明了干细胞的分化潜力，也再次证明了胚胎干细胞确实贡献到了嵌合体猴。”

　　此外，研究团队在两只嵌合体的胎盘组织中都发现了高比例的胚胎干细胞贡献。考虑到此前小鼠胚胎干细胞几乎不会贡献到胎盘组织，说明灵长类胚胎干细胞可能具有独特的发育全能性。他们在两只嵌合体猴的生殖细胞中也发现了胚胎干细胞的高比例贡献，这为构建遗传修饰模型猴奠定了技术基础。

　　“利用灵长类多能干细胞生产嵌合体是这一领域长期追求的目标。原则上，这项研究将为相关基础研究和非人类灵长类遗传修饰模型的产生开辟新途径。具体来说，利用胚胎干细胞实现基因修饰能力，将使完成目前在受精卵或胚胎阶段使用CRISPR技术难以实现的研究成为可能。”一位审稿人如是评价。

　　作为一名中国本土科学家，刘真从研究生到博士后一直在神经科学研究所工作。他是一名敢于在“无人区”冒险的科学家。

　　克隆猴是一直以来没被解决的问题，甚至曾被断言不可能解决。2018年，仍在从事博士后研究的刘真作为第一作者和导师孙强以封面文章形式在《细胞》发表体细胞克隆猴“中中”“华华”。这一科研成果让全球科学界瞩目。

　　此外，刘真作为第一作者建立的自闭症非人灵长类模型、世界首例生物节律紊乱体细胞克隆猴模型先后发表于《自然》《国家科学评论》等期刊。今年4月，他作为通讯作者和团队在《细胞-干细胞》发表的体外重构非人灵长类类囊胚研究，首次将非人灵长类的类囊胚体外培养至着床后原肠胚时期。英国牛津大学干细胞生物学家Alejandro De Los Angeles评论称：“这些发现是干细胞类胚胎模型领域的一个里程碑。”

　　“做科研一定要敢于冒险。”刘真说，“就像研究生入学时，蒲慕明院士讲的那样，要敢于啃‘硬骨头’。”

　　生命科学前沿的路并不好走。除了科研方面的难题，每一次，刘真与合作者们介绍研究成果时，必然会被“拷问”相关伦理问题。比如嵌合体研究是否会带来像希腊神话中“奇美拉”一样的怪物。

　　“目前，我们开展的只是基础科学研究。相关研究未来对基因工程技术发展和濒危物种保护有实际意义，可以帮助我们构建更精确的猴模型，用于神经系统疾病以及其他生物医学领域的研究。”他说，比如建立“渐冻症”动物模型，推动相关疾病治疗。

　　下一步，研究人员希望提升嵌合体猴的培育效率，并进一步探索制约嵌合体猴生存的因素。

　　据介绍，首只胚胎干细胞系“嵌合猴”仅存活了10天，其背后的原因目前研究团队尚不清楚。他们仅发现嵌合体中由胚胎干细胞发育而来的细胞和由受体胚胎细胞发育而来的细胞在表观遗传修饰上存在一些差别。

　　截至目前，我国累计批准发布国家标准物质19007项，其中1—7月新批准发布国家标准物质549项，同比增长56%。

　　一项发表于《自然-神经科学》的研究，首次成功建立了线粒体功能障碍与神经退行性疾病的因果关系。

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